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我国药用植物原生质体培养研究进展 　　摘要：对近年来药用植物原生质体的制备、培养、融合以及植株再生进行了综述，阐明了起始材料、酶解条件、培养方法等对原生质体培养的影响，并对今后药用植物原生质体的重点研究方向作了讨论。 　　关键词：药用植物；原生质体；酶解条件；培养；研究进展 　　中图分类号：Q942 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2015）03-0243-03 　　原生质体（protoplast）是指植物细胞中除去细胞壁后有生命活性的部分，除去细胞壁的原生质体能够直接摄入外源的细胞器、DNA、病毒、质粒等，是进行遗传转化研究的理想受体，对其进行细胞融合可获得杂种细胞[1]。因此，植物原生质体在品种改良和生物学基础理论研究中有广泛的应用前景，备受国内外研究学者的关注。1892年，Klercker首次用机械法进行原生质体的分离研究，但是原生质体获得量很少[2]。1960年，Cocking采用酶解法从高等植物细胞中分离获得原生质体[3]。随着纤维素酶和果胶酶的推行，植物原生质体培养逐渐成为一个热门话题[4]。1971年，Takebe等首次从烟草叶片中分离出原生质体并获得再生植株，原生质体的培养进入一个新的阶段[5]。在此基础上，药用植物原生质体的培养也有了一定的发展。目前，药用植物原生质体的培养已经扩展到夹竹桃科、五加科、紫草科、菊科、龙胆科、葫芦科、茄科、玄参科、天南星科等数十科。本文就近年来药用植物原生质体的制备、培养、融合以及植株再生进行综述，为今后药用植物原生质体培养的研究寻求切入点和突破点，提供新的研究方法和有力的论证依据。 　　1 原生质体的分离 　　原生质体分离是进行原生质体培养的第1步，直接影响原生质体培养能否成功。其中，原始材料的生理状态，原生质体的分离、预处理方法以及游离纯化方法等都是影响原生质体分离的重要因素。原生质体的分离方法主要有机械法和酶解法2种。机械法存在产量低等缺陷，因此多采用酶解法进行原生质体的分离。 　　1.1 原始材料的选择 　　原始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响[6]。生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活性原生质体的关键，并对原生质体的复壁、愈伤组织的形成以及植株再生有重要的影响。原生质体分离的原始材料有很多，只要选用的酶类型及用量合适，就可以在植物的任何部位获得游离的原生质体[2]。据有关原生质体培养的报道，叶片是分离原生质体试验中常用的原始材料[7]。张晓丽等以青天葵新鲜叶片为试验材料获得制备青天葵原生质体的理想条件与参数[8]。愈伤组织和悬浮细胞生长迅速稳定，受环境条件影响比较小，更易获得大量高质量的原生质体。但是，长期培养的愈伤组织和悬浮细胞容易引起植株丧失再生能力，这就须要选择胚性状态的细胞团，这是再生植株所必需的[9-10]。同时，基因型也会影响植物原生质体的培养，不同基因型分离得到的原生质体产量和活力差别很大[11]，并且对原生质体的植株再生也有一定的影响[12]。 　　1.2 原始材料的预处理 　　一些研究表明，材料的预处理对保持原生质体的完整性及提高原生质体产量有积极的作用。张晓丽等用13%甘露醇溶液预处理青天葵叶片1 h，获得大量的原生质体[8]。王鹏凯等以北美鹅掌楸的悬浮细胞和组培苗叶片为材料，用含有0.1% 2-吗啉乙磺酸（MES）和0.6 mol/L甘露醇的Cell Protoplast Wash （60M-CPW）溶液25 ℃预处理 1 h，结果显示原生质体产量明显提高[13]。于相丽等以洛阳红牡丹叶片为材料制备原生质体，在蔗糖浓度为0.3 mol/L的溶液中预处理0.5 h的效果最好[14]。但是，并不是所有的原生质体分离都需要经过预处理，要根据不同的情况而定。 　　1.3 原生质体的分离方法 　　药用植物游离原生质体常用的酶有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、离析酶等，不同植物材料选用哪种酶较好取决于所用细胞和组织的来源。不同种类酶的混合使用和精确的酶解温度和酶解时间的设置，可以得到较好的酶解效果[15-16]。近年来，开发一种微生物型的纤维素酶和果胶酶用于原生质体分离逐渐成为讨论的焦点[17]。 　　渗透压是影响原生质体游离的一个重要因素。渗透压过低，原生质体缺乏细胞壁的保护，往往会出现破裂的情况。有研究表明，微高的渗透压有利于原生质体维持稳定的形态[18]。渗透压稳定剂是酶液的重要组成部分，应当引起足够的重视。药用植物原生质体分离环境中常用的渗透压稳定剂为甘露醇和山梨醇[19-20]，甘露醇由于在试验中的降解性小于山梨醇而被认为是目前最适合的渗透压稳定剂。 　　1.4 原生质体游离基纯化方法 　　原生质体游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法，其中沉降界面法使原生质体集中在两相