重组hmgb1对den2感染ana-1细胞分泌tnf-α及no的影响-effect of recombinant hm gb1 on secretion of tnf - α and no by den 2 infected ana - 1 cells.docxVIP

贵阳 贵阳 医 学 院 2013 届 硕 士研 究 生论 文 PAGE PAGE 10 重组 HMGB1 对 DEN2 感染 Ana-1 细胞分泌 TNF-α 及 NO 的影响 专业：免疫学 研究生：孙伟 导师：左丽 教授，商正玲 副教授 摘 要 目的： 观察不同浓度重组高迁移率族蛋白 1(recombination high mobility group box protein 1，rHMGB1)对 DEN2 感染鼠源单核巨噬 细胞 Ana-1 产生 TNF-α 和 NO 的影响。 方法：直接免疫荧光及 RT-PCR 鉴定 DEN2 感染 Ana-1 细胞； Real-time PCR 动态监测 DEN2 感染 Ana-1 细胞后胞内病毒增殖情 况；DEN2 感染 Ana-1 细胞后，与不同浓度重组 HMGB1 进行培 养,Real-time PCR 检测 24h 时间点感染组及不同浓度重组 HMGB1 组中病毒载量情况；以双抗体夹心 ELISA 方法检测各组上清液中 TNF-α 的分泌水平；以 Griess 试剂检测各组上清液中 NO 含量。 结果： 1. DEN2 感染 Ana-1 后，直接免疫荧光检测到 DEN2 并且 RT-PCR 检 测到病毒的目的基因 NS5，条带大小为 177bp,证实 DEN2 可以感染 Ana-1 细胞。 2. Real-time PCR 动态监测 DEN2 感染 Ana-1 胞内病毒载量，在 24h 病毒载量达高峰，48h 病毒载量水平显著下降，2-△ △ Ct 值分别为 50241.67 ±9570.96 ,71.67±23.67，差异具有显著性统计学意义（P ＜0.05）。DEN2 NS5 引物的熔解曲线波峰单一，峰形锐利。 3. Real-time PCR 检测不同浓度重组 HMGB1 处理组的病毒载量， 与 DEN2 组相比，D-HMGB1（即 DEN2-HMGB1）处理组病毒载 量 明 显 下 降 ， D-HMGB1-1 组（ HMGB1 处 理 浓 度 为 1ng/ml） ﹑ D-HMGB1-10 组（HMGB1 处理浓度为 10ng/ml）﹑D-HMGB1-100 组（HMGB1 处理浓度为 100ng/ml）和 D-HMGB1-1000 组（HMGB1 处理浓度为 1000ng/ml）抑制率（%）分别为 41.53±2.12﹑55.30±1.59 ﹑ 74.75±1.12 ﹑ 86.35±1.42 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （ P ＜ 0.05 ）。 随 rHMGB1 处理浓度增加，对胞内病毒增殖的抑制率增 大。 4. 双抗体夹心 ELISA 法检测 TNF-α 浓度，与 DEN2 组比较， D-HMGB1 组 TNF-α 浓度有所下降，且 rHMGB1 浓度越大，TNF-α 浓度下降越明显，差异有统计学意义（ P ＜0.05）。 5. Griess 试剂检测 NO 含量，rHMGB1 作用后 NO 浓度明显减少， 与 DEN2 组比较，差异有统计学意义（P ＜0.05）。 结论： 1.在体外 DEN2 可以感染 Ana-1 细胞； 2.重组 HMGB1 对 DEN2 在 Ana-1 胞内的复制，有一定抑制作用。病 毒抑制率与 rHMGB1 浓度成正相关； 3.重组 HMGB1 对 DEN2 感染 Ana-1 分泌 TNF-α,NO 有一定抑制作用， rHMGB1 浓度越高，TNF-α 和 NO 的分泌量越少。 关键词：DEN2；HMGB1；Ana-1；TNF-α；NO 1.前言 登革病毒（Dengue virus, DEN）属黄病毒科黄病毒属，是单链正义 RNA 病毒[1]。其基因组全长约 10.7kbp,可编码 3 种结构蛋白 (C、M、E) 和 7 种非结构蛋白 (NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5) [2,3]。 登革病 毒（DEN）可分为四种血清型：DEN 1-4。主要以白纹伊蚊或埃及伊蚊为媒 介，在人-蚊间进行传播[4，5]，感染人体后可以引起人的登革热(Dengue fever, DF)、登革出血热(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合症 (dengue shock syndrome, DSS),其中 DEN2 引起的症状较为严重[6， 7， 8， 9]。 目前，世界范围内的某些地区登革感染疫情还有上升趋势 [10]。DEN 感染引 发全身无法控制的炎症和出血症状与机体出现的异常免疫应答密切相关 [4,11]。 MΦ（单核巨噬细胞）是 DEN 感染的靶细胞，DEN 可以在其中增殖，并 随细胞的迁移而感染机体其他细胞。MΦ被 DEN 感染活化，可以分泌多种细 胞因子、