板栗CmMYB转录因子基因克隆及在花序发育中表达分析.docVIP

板栗CmMYB转录因子基因克隆及在花序发育中表达分析 　　摘　要：板栗大量雄花序影响产量形成，寡雄性状是板栗重要的育种目标。利用RT-PcR与RACE扩增方法，从板栗极短雄花序芽变和正常雄花序cDNA中分离出一个板栗MYB转录因子cDNA全长，进行测序和序列分析。结果表明，克隆的cDNA片段总长为1522bp，基因内部含有完整的开放阅读框架，大小为1071bp，可编码长度为357个氨基酸残基的蛋白质，所推导的蛋白质氨基酸序列与苹果的MyB91、豌豆的MYB转录因子和蒺藜苜蓿的MYB转录因子基因分别具有88％、87％和87％的氨基酸序列同源性。序列分析及空间结构预测发现该序列具有完整的R2R3区域，推测其具有转录激活功能。命名为CmMYB(GenBank登录号为GU076490)。实时荧光定量PCR结果显示，芽变雄花序CmMYB日转录因子在雄花序原基形成期、花簇原基形成期、花朵原基形成期、雄蕊原基形成期和花药形成期的表达量均低于正常雄花序中的表达量，而在花被原基形成期表达量高于正常雄花序中表达量，说明该转录因子调控的主要基因与雄花序的短化存在一定联系。 　　关键词：板栗；雄花序；MYB转录因子；荧光定量PCR 　　中图分类号：S664.2　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2010)05-713-06 　　 　　板栗雄花序为圆柱状菜荑花序，正常的雄雌花比例为24D0～4000:1左右，雄花量极大，其消耗树体贮存营养的20％～40％，是造成板栗低产的重要原因之一。选育雌花多，雄花数量少、雄花序退化或早期脱落的丰产优质品种便成为板栗育种的一个目标。1995年在北京市密云县板栗产区发现1株雄花序短缩的变异类型，主要表现为雄花序短小，平均长度仅有2.2cm，其雄花序在生长发育进程中，花序顶端由变黄到弯曲至脱落死亡，基部留下的花序短小，雄花簇和花粉发育与对照无差异。通过对短雄花序发育中上部自然衰落的异常死亡现象研究，证明该异常由细胞程序性死亡而致。课题组前期预试验对板栗雄花序进行不同浓度的外源激素(赤霉素、生长素、脱落酸、乙烯、芸苔素和细胞分裂素)处理，发现只有经过高浓度赤霉素处理的芽变短雄花序恢复生长，说明赤霉素含量降低可能诱导发生细胞程序性死亡而引起板栗雄花序的短缩。 　　转录水平的调控是基因表达调控的重要方式，转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区顺式作用元件(cis-acfing factor)特异性结合的DNA结合蛋白。它通过与靶基因的互作以及和其他相关蛋白的联系来调节基因表达的强度，应答激素刺激和外界环境胁迫，或控制基因的时空特异性表达。根据DNA结合功能域的结构，转录因子可分为数个典型的转录因子家族，MYB转录因子家族即为其中之一。MYB转录因子家族成员以含有MYB结构域为共同特征，按所含MYB结构域的数目，MYB类转录因子可分成3种类型，即分别含1个、2个和3个MYB结构域。植物中绝大多数MYB转录因子都只含有2个MYB结构域，称为R2R3-MYB蛋白。R2R3-MYB基因广泛参与植物各种生理调节过程，如参与植物次生代谢的调节；参与对环境胁迫，光和激素的应答；参与植物特有器官的形成，如调节根毛、气孔、表皮毛表皮细胞的特化，调节叶片的形态建成等。最近，Aya等通过对水稻的GA缺陷型、GA不敏感型和GAMYB突变体研究发现，GAMYB能够直接激活GA调控代谢中的一个脂代谢基因CYP703A3，从而调控花粉粒外壁发育和花药绒毡层细胞的程序性死亡。Kaneko等研究发现大麦GAMYB在花器官发育和花粉发育过程中起着重要的作用。所以我们以板栗正常雄花序和芽变短雄花序为试材，拟克隆获得板栗与赤霉素相关MYB转录因子基因，并对其基因及其编码蛋白序列进行分析，同时，采用实时荧光定量PCR技术对不同时期的基因表达量进行检测和分析，研究板栗MYB转录因子的调控作用，为芽变板栗短雄花序分子机理研究提供理论基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1.1　试验材料 　　试材为板栗(Castartea mollissima B，1)正常雄花序和芽变短雄花序，源于北京市密云板栗产区。从2008年5月3日花序萌发开始，到5月27日花药萌发为止，按照板栗雄花序不同发育时期，共采样6次，3次重复。 　　1.2　总RNA的提取及cDNA第一链的合成 　　用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)提取正常雄花序的总RNA，利用Clonteeh SMARTTMLibrary试剂盒(购自Clontech)合成3-RACE和5-RACE cDNA第一链。 　　 　　1.3　板栗MYB转录因子基因序列的克隆 　　根据GenBank中公布的苹果(DQ074473.1)、拟南芥(A