毛细管电泳前沿分析法及分子模拟辅助研究牛血清白蛋白与荧光素钠相互作用.docVIP

毛细管电泳前沿分析法及分子模拟辅助研究牛血清白蛋白与荧光素钠相互作用 　　摘 要 应用毛细管电泳前沿分析法研究了荧光素钠与牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用，利用游离荧光素钠平台峰高度和荧光素钠浓度与峰高的线性关系得出游离以及与BSA结合的荧光素钠浓度，将不同浓度比的荧光素钠-BSA相互作用体系进行电泳，考察结合情况，进一步采用非线性方程和线性方程对数据进行拟合处理，得到了荧光素钠和蛋白质在286和294 K下的结合常数及结合位点数；通过考察热力学参数推断二者之间主要以疏水作用力结合;借助计算机软件对二者之间的相互作用进行了模拟分析。 　　关键词 荧光素钠； 牛血清白蛋白； 毛细管电泳前沿分析； 相互作用?? 　　 　　 　　1 引 言?? 　　荧光素及其衍生物不仅常作为生物大分子指示剂及生物细胞染色剂，同时在卫生保健领域也得到应用，如在作为诊断试剂方面，荧光素钠注射液是眼底血管荧光造影首选造影剂，也用于手术中显示胆囊和胆管，以及结核性脑膜炎的辅助诊断。荧光素类衍生物还可作防腐药和轻泻剂。此外，国外已有荧光素用于诊断癌症的报导，且其本身具有一定抗癌作用。血清白蛋白在血浆中各种内源性和外源性化合物存储与转运中发挥重要作用。目前对荧光素生物结合反应的作用机理和平衡规律尚在研究中，尤其近来发现注射荧光素钠注射液会有不良反应，因此研究荧光素钠与血清白蛋白的相互作用对理解药物作用机理，提高药效和开发新药具有一定的意义。荧光素的化学名为9-（2-羧基苯基）-6-羟基-3H-咕吨-3-酮，荧光素钠的结构见图1。?? 　　毛细管电泳方法是目前获得大分子和小分子相互作用的重要方法之一，具有高效、快速、模式多变、耗样量少，对样品纯度要求不高及更接近体内的结合行为等优点。当前，偶氮类、噻嗪类和吖啶类等染料被广泛应用于临床和医药领域，但是利用毛细管电泳方法研究蛋白质与染料结合的报道并不多。文献\采用荧光光谱考察荧光素钠和BSA的相互作用，但该实验是在pH 2.2 的条件下进行的。本研究利用毛细管电泳前沿分析技术，在接近生理条件下研究荧光素钠和牛血清白蛋白（BSA）之间的相互作用，对荧光素钠和BSA之间的结合常数、结合位点数目以及热力学作用类型进行考察，并借助计算机模拟探讨二者之间的结合方式，为掌握药物和人血清白蛋白的结合机制提供线索。 　　2 实验部分?? 　　2.1 仪器与试剂?? 　　HP3DCE型高效毛细管电泳仪（Agilent Technologies公司），DAD检测器； 0.01 mol/L Tris-HCl电泳缓冲液（pH 8.0）；未涂渍熔融石英毛细管柱（40 cm×50 　　??@ m I.D.，邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司）。电泳采用压力进样：5.0 kPa, 40 s; 分离电压15 kV。荧光素钠和BSA购自北京拜尔迪生物公司。?? 　　2.2 实验方法?? 　　 　　配制荧光素钠与BSA（10 　　??@ mol/L）不同浓度比的混合溶液，混匀，过夜孵育后进行电泳，由游离荧光素钠的浓度与其平台峰高度的标准曲线（10～220 　　??@ mol/L）计算游离药物浓度，进而得到与BSA结合的药物浓度（表1），再分别采用非线性回归及线性方程拟和实验数据，计算结合常数和结合位点的数据。 　　3 结果与讨论?? 　　3.1 进样时间的优化?? 　　考察不同进样时间（10～50 s）对平台峰形成的影响。实验表明，在荧光素钠（400 　　??@ mol/L）和BSA（??8 　　??@ mol/L??）混合样品中，游离荧光素钠的峰高随进样时间的延长而逐渐增加，同时峰形变宽，逐渐形成平台峰。当进样时间为30 s时，平台峰高基本不再增大（图1）；40 s时得到的荧光素钠平台峰峰高重现性良好，并且平台峰峰高和浓度呈良好的线性关系。本研究最终选择40 s作为实际电泳实验的进样时间。 　　?? 图1 荧光素纳的结构和进样时间对平台峰的影响?? 　　Fig．1 Stracture of fluorecein effect of injection time on plateau peak height 　　 　　 图2 荧光素钠（FS）和BSA（100 　　??@ mol/L）混合平衡溶液样品在490 nm波长下电泳谱图?? 　　Fig．2 Electrophoretogram of fluorescein sodium（FS）-BSA mixture solution at wavelength of 490 nm?? 　　FS concentration( 　　??@ mol/L): a. 50; b. 80; c.120; d.160; e. 200. 　　3.2 286和294 K