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桦木酸对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖影响 　　摘要：目的 观察桦木酸（betulinic acid，BA）对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。方法 体外培养人肝癌HepG2肿瘤干细胞并证明其自我更新能力。CCK-8法检测40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L BA作用人肝癌HepG2肿瘤干细胞24、48 h的细胞活力；40、20、10、5 μmol/L BA作用人肝癌HepG2肿瘤干细胞48 h，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。结果 BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖有明显的抑制作用，并呈一定的量-效关系；BA能明显影响肿瘤干细胞周期，诱导肿瘤干细胞凋亡，40 μmol/L BA明显阻滞细胞周期于S期，且细胞凋亡率达到10.86%。结论 BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖具有明显的抑制作用，其可能通过影响肿瘤干细胞周期及诱导肿瘤干细胞凋亡而发挥作用。 　　关键词：桦木酸；石见穿；人肝癌HepG2细胞；肿瘤干细胞；细胞凋亡 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0060-05 　　肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显示，肝癌在60岁以下的男性中属发病率最高和死亡率最高的癌症[1]。由于肝癌的高复发、高转移率和化疗抗药性，治疗效果并不乐观。近年来，越来越多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗 　　法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞，更重要的是靶向其中的肿瘤干细胞[2-3]。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤组织中存在的极小部分细胞，通常处于静止状态，当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发，这均源于CSC拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。我们前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内筛选，发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤作用[4-5]，进一步对石见穿进行化学成分分析，发现桦木酸（betulinic acid，BA）为石见穿发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一。因此，本实验观察BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。 　　1 实验材料 　　1.1 细胞株 　　人肝癌HepG2细胞株，中国科学院细胞库，目录号TCHu72。 　　1.2 主要试剂与仪器 　　BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普药业），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培?B基（Gibco），肝素（Sigma），B27神经细胞生长添加剂（Gibco），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Acro Biosystem），成纤维细胞生长因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青链霉素混合液（Solarbio），磷酸盐缓冲液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），无酚红DMEM（Macgene），CCK-8试剂盒（Dojindo），细胞周期试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（BD）。MCO175型CO2培养箱（德国Galaxy公司），TH-200型显微镜（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶标仪（美国Biotek公司），IEC-CL31R型离心机（美国Thermo Fisher公司），NAVISO型流式细胞仪（美国Bechman Coulter公司），JCSO344型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama公司）。 　　2 实验方法 　　2.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞培养 　　参考文献[6-7]进行无血清培养基的制备及人肝癌HepG2肿瘤球干细胞的培养和传代。 　　2.1.1 无血清干细胞培养基制备 在DMEM/F12培养基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。 　　2.1.2 细胞培养 正常培养人肝癌HepG2细胞，胰酶消化无血清培养基重悬，计数，稀释为2×103/mL，2.5 mL/孔，则5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。1 d后可观察到有悬浮细胞球形成。每3 d半量换液。 　　2.1.3 细胞传代 当细胞形成悬浮细胞球（约6 d），进行传代培养。将含细胞培养液悬浮细胞收集于离心管中，800 r/mi