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牡丹花瓣脂氧合酶测定方法研究 　　摘　要：采用紫外分光光度法，以亚油酸钠为反应底物，研究了牡丹花瓣脂氧合酶(LOX)的酶学特性并建立了其测定体系。结果表明，牡丹花瓣脂氧合酶反应的最适pH值为4.5，最适温度为45℃，最适底物浓度为0.594mmol／L。该酶有着较好的热稳定性,90℃保温1h后仍保持较高活性。 　　关键词：牡丹花瓣；脂氧合酶(LOX)；测定方法 　　中图分类号：Q556 文献标识号：A 文章编号：1001―4942(2010)09―0091―04 　　 　　牡丹是原产我国的世界名花，具有很高的观赏性和药用价值。牡丹花朵较大，开花期间香气浓郁，目前已分离到的与牡丹花瓣芳香气味有关的化合物主要是一些醇、醛、酯类物质。在植物体内，这些小分子物质主要是由脂氧合酶／脂氢过氧化物裂解酶(LOX／HPL)联合催化途径催化产生，其中LOX是该途径的首个酶，也是一个关键酶。 　　脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX)，又叫亚油酸氧化还原酶、脂肪氧合酶、脂肪加氧酶或类胡萝卜素氧化酶，广泛存在于哺乳动物、植物和微生物中。LOx是一种含非血红素铁或锰的加氧酶，能专一催化包括亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸在内的具有顺，顺－1，4－戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其相应酯的加氧反应，从而生成具有共轭双键的脂肪酸氢过氧化物(Hydroperoxides，HPOD)。在花瓣中，HPOD再进一步被脂氢过氧化物裂解酶(Hydropemxide Lyase，HPL)及其下游一系列的酶催化，从而生成各种挥发性的小分子醇、醛和酯类物质。 　　目前，测定LOX活性的方法很多。常规的实验室测定方法有分光光度法、氧电极法、同位素标记法等；快速测定方法有亚甲蓝染色法(MBB)、胡萝卜索染色法(CB)、淀粉一碘化钾法(KI－S)等。其中，分光光度法具有快速、简便和易于连续测定的优点，有利于花瓣LOX酶学性质的研究以及简便、准确、重复性好的LOX活性测定体系的建立，可为牡丹芳香气味形成的生理基础研究提供依据。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　材料 　　试验材料为盛花期的牡丹(洛阳红)，试剂均为国产分析纯。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1　反应底物(亚油酸钠母液)的制备参照Surrey等的方法，略作修改。取50μl亚油酸加入到溶有0.1gTween 20的8ml重蒸水中，然后用1mol／L氢氧化钠溶液滴至澄清，定容至20ml，于冰箱中冷藏备用。 　　1.2.2　粗酶液的提取取2.0g花瓣于冷研钵中，加入预冷的0.2mol／L磷酸缓冲液(pH7.0)和0.1g的PVP，加入石英砂后研磨，组织匀浆在冷冻离心机(4℃)中15000×g离心30min，收集上清液，30℃冰箱保存，用于相关指标测定。 　　1.2.3　LOX活性的测定 参照Axelrod等(1981)的方法，反应温度为室温，反应体系为3ml(含有缓冲液2.930ml，酶液25μl，底物45μl)，加入酶液15s后开始计时，记录3min内OD234值的变化，酶活性以AOD234／(gfw?min)表示。重复3次。 　　1.2.4　牡丹花瓣LOX最适pH值的测定设定不同pH条件：pH 3.0-6.0为磷酸二氢钠一柠檬酸缓冲液，pH6.5―7.5为磷酸氢二钠―磷酸二氢钾缓冲液，pH8.0―9.0为硼酸一硼砂缓冲液，缓冲液的浓度均为0.2mol／L，在室温(25℃)下测定LOX活性，测定体系同1.2.3。 　　1.2.5　牡丹花瓣LOX最适反应温度的测定将试管置于一定温度(0、5、10、15、20、25、30、35、4D、45、50℃)的水浴中，依次加入粗酶液25μl、PBS缓冲液(pH4.5，0.2mol／L)2.935 ml，预热3min后加入亚油酸钠母液45μl。加入底物15s后立刻准确计时，记录OD234值，然后水浴10min，记录10min内的OD值，酶活性以AOD234／(gFW?min)表示。重复3次。以LOX活性最大时的温度作为牡丹花瓣LOX的最适反应温度。 　　1.2.6　牡丹花瓣LOX最适底物浓度的测定在室温(25℃)、pH 4.5的条件下，于不同底物浓度下反应，测定LOX酶活性。测定体系同1.2.3，在3ml反应体系中分别加入底物亚油酸钠母液5、15、25、35、45、55、65、75μl，通过调节所加缓冲液的体积来保证最终3ml体系不变。 　　1.2.7　牡丹花瓣LOX的热稳定性研究在pH4.5的条件下，采用含45μl亚油酸钠母液的反应体系(同1.2.3)，于不同温度(30―90℃)处理LOX粗酶液1h后，立即置于冰上，在室温(25℃)下测定酶活。 　　 　　2　结果与分析 　　 　　2.1　牡丹花瓣LOX反应的最适pH值和