疏肝活血中药对骨髓间充质干细胞移植心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能和心肌病理形态影响.docVIP

疏肝活血中药对骨髓间充质干细胞移植心肌缺血再灌注损伤大鼠心功能和心肌病理形态影响 　　摘要：目的 观察疏肝活血中药对骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植心肌缺血再灌注损伤（IRI）大鼠心功能和心肌病理形态的影响，探讨其对心肌保护的作用机制。方法 采用结扎冠关动脉方法制备心肌IRI模型。SD大鼠随机分为假手术组、IRI组、BMSCs组和疏肝活血中药+BMSCs联合组（联合组），联合组予以疏肝活血中药灌胃，其余各组灌胃等量生理盐水。4周后，光镜下观察心肌病理形态，超声心动图检测心功能。结果 与BMSCs组比较，联合组心功能明显改善，差异有统计学意义（P0.05，P0.01）；病理形态观察显示，联合组可以明显改善大鼠心肌结构和病理形态。结论 疏肝活血中药可以改善BMSCs移植IRI大鼠心肌病理形态和心功能。 　　关键词：疏肝活血中药；骨髓间充质干细胞；缺血再灌注损伤；心功能；大鼠 　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.08.015 　　中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）08-0054-03 　　迄今为止，尽管冠状动脉内溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉内支架置入等心脏再灌注治疗，可以显著提高心肌梗死患者的存活率，但不能使 　　基金项目：教育部博士学科点基金（20104323120005）；湖南省自然科学基金（12JJ3114）；中国博士后基金（20110491254）；湖南省教育厅基金（11C0962） 　　已经梗死的心肌细胞再生。干细胞移植技术的出现与成熟，为病损心肌细胞重建提供了全新的治疗策略。研究表明，干细胞具有自我复制和跨系统分化潜能，能在特定条件和微环境下分化成有功能的心肌细胞，改善心功能[1-2]。中医药虽早已介入有关干细胞的研究领域，但中医药促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖分化的机制尚不清楚。本实验通过BMSCs移植于缺血再灌注损伤（IRI）大鼠，进行疏肝活血中药干预，检测移植后心功能、心肌病理形态，探讨其是否可促进BMSCs移植IRI大鼠心功能和心肌病理形态的改善及其促进心肌修复的作用机制。 　　1 实验材料 　　1.1 动物 　　32只大鼠，体质量200～250 g；取BMSCs选用6～8周龄清洁级雄性SD大鼠，体质量130～150 g。实验动物购自湖南中医药大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（湘）2009-0001。 　　1.2 药物、试剂与主要仪器 　　疏肝活血中药（柴胡10 g，丹参20 g，檀香15 g，赤芍10 g，川芎10 g，当归10 g，红花5 g等），浸泡，去渣，浓缩至药液浓度1 g原药材/mL，保存备用，湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供。FITC标记CD11b、CD45、CD90抗体（美国SERANTEC公司）。小动物呼吸机（DW-2000型，上海嘉鹏），多道生理信号采集处理系统（RM-6280型，成都仪器厂制造）。 　　2 实验方法 　　2.1 造模 　　参照文献[3]方法。大鼠用25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉后固定，气管切开，连接动物呼吸机，开胸暴露心脏，于左心耳下左冠状动脉前降支上1/3处穿线，以心电图QRS波群增高增宽、ST段抬高，心肌颜色发绀，为结扎成功，以ST段下降1/2、缺血部位心肌颜色恢复为血流再灌注成功。 　　2.2 骨髓间充质干细胞分离、培养和鉴定 　　采用常规方法进行BMSCs分离、培养与传代，取第4代BMSCs，加入FITC荧光标记的抗CD11b、CD45、CD90抗体，对照组加PBS，采用FACScan流式细胞仪检查细胞表面抗原CD90阳性细胞率均达到97.7%，CD34阳性率4%和CD45阳性率1.4%（均小于5%）。细胞均一性较好，纯度较高，符合实验要求。 　　2.3 分组与造模 　　SD大鼠随机分为假手术组、IRI组、BMSCs组、疏肝活血中药+BMSCs联合组（联合组），每组8只。假手术组开胸穿线不结扎冠状动脉，余各组行IRI造模，开胸结扎冠脉30 min，恢复冠脉血流；BMSCs组和联合组在心肌结扎30 min后，于心肌梗死区边缘心肌组织的3个位点直接注入共100 μL的BMSCs细胞悬液（含细胞数3×106），假手术组和IRI组在穿线的心肌边缘直接注入100 μL的PBS缓冲液。 　　2.4 给药 　　给药剂量根据成人（60 kg）临床剂量，按动物体表面积换算，联合组灌胃疏肝活血中药10 mL/（kg?d），相当于原药材含量10 g/（kg?d），余各组灌胃等量生理盐水。连续5 d（术前2 d、术后3 d），1次/d。 　　2.5 心功能检测 　　大鼠在术后4周，在麻醉状态下分别进行超声心动图检测，使用HP