粪肠球菌体外根尖生物膜模型建立及形态学研究.docVIP

粪肠球菌体外根尖生物膜模型建立及形态学研究 　　[摘要] 目的 通过体外实验建立根尖生物膜模型，观察粪肠球菌根尖生物膜模型的形态及结构。方法 选取人新鲜拔除的单根离体牙24颗，随机分为8组，每组3颗，浸泡于粪肠球菌ATCC 29212菌悬液中，分别于1、2、7 d建立根尖生物膜模型。使用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜形成过程；使用碘化丙啶（PI）和刀豆球蛋白A异硫氰酸荧光素（ConA-FITC）对生物膜细菌及细胞外基质进行双染色，通过激光共聚焦扫描电子显微镜（CLSM）观察其形态和结构；计算生物膜覆盖率。结果 随时间的增加，根尖样本表面细菌覆盖面积增加，7 d组与1、2 d组间的差异存在统计学意义（P0.05）。7 d组形成生物膜结构，其样本表面的覆盖率为17.23%±1.52%，样本表面有大量细菌附着，细菌被细胞外基质包绕，并呈群落分布。生物膜中的细菌被PI染成红色，细胞外基质被ConA-FITC染成绿色，可见多层次的空间结构以及亲水性通道。结论 粪肠球菌根尖生物膜于培养7 d时形成完整的生物膜结构，由细菌群落及其周围大量的不定型基质组成。 　　[关键词] 粪肠球菌； 根尖生物膜； 根管治疗后疾病 　　[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.04.002 　　粪肠球菌是根管治疗失败患牙最常分离出的细菌之一，被认为是导致根管治疗后疾病的重要因素。研究[1-3]显示，80%以上的慢性根尖周炎和持续性根尖周炎患牙的根尖牙骨质表面存在细菌生物膜。对根尖生物膜的形成及致病机制的研究[4-6]发现，粪肠球菌的生物膜结构可能使细菌具有更强的致病性，且很难被彻底清除，但具体机制仍有待深入研究。目前，建立粪肠球菌根管内生物膜模型的报道较多[5，7-11]，而对根尖生物膜模型的研究则非常罕见。本研究的目的是建立粪肠球菌根尖生物膜的体外模型，为粪肠球菌在根尖周炎中致病机制的研究奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 仪器和试剂 　　离体人牙；粪肠球菌（粪肠球菌标准株ATCC 29212，北京口腔医学研究所保藏管理中心），CDC培养基；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、刀豆球蛋白A异硫氰酸荧光素（ConA-fluorescein isothio-cyanate，ConA-FITC）荧光染液（Sigma公司，美国）；激光共聚焦培养皿（MatTek公司，美国），生化培养箱，扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）、激光共聚焦扫描电子显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）（Lei-ca公司，美国）；Photoshop CS5图像分析软件，Lei-ca Q win图像分析软件。 　　1.2 离体牙的选择及处理 　　选取因正畸减数需要而新鲜拔除的人单根管前磨牙24颗，要求根尖发育完全，根面无龋坏，无根裂或牙根外吸收。剔除根尖1/3过度弯曲的牙齿，清除样本表面的牙周膜。 　　1.3 根尖生物膜模型的建立 　　1.3.1 根尖样本的制作 将离体牙标本截去牙冠并拔髓，用ProTaper镍钛系统冠向下方法进行根管预备，预备至F2后用质量分数15%的乙二胺四乙酸（ethyle-nediamine tetraacetic acid，EDTA）溶液5 mL作用3 min，5.25%次氯酸钠溶液和生理盐水交替超声荡洗5 min，热牙胶根管充填，充填后拍摄X线片，若恰填则证明根管封闭可靠。截取离体牙7 mm长度的牙根，将其固定于树脂基底座上，将金属结扎丝末端也固定于树脂基底座上，上方连接于玻璃瓶胶塞内，悬吊根尖样本；将玻璃瓶胶塞中穿入注射针头，使瓶内与厌氧罐中气压一致（图1）；样本紫外线消毒后置于无菌厌氧血琼脂CDC液体培养基中37 ℃下厌氧培养2 d，若液体培养基澄清，说明样本消毒彻底，4 ℃存放备用。 　　1.3.2 粪肠球菌菌液培养 粪肠球菌解冻复苏，于生化培养箱中37 ℃下厌氧培养，然后分离纯化，增菌并收集菌膜，置于无菌CDC液体培养基中，调整菌液密度为1×108 CFU?mL-1，备用。细菌在CDC琼脂板培养基上生长，形成菌落呈乳脂状白色者为粪肠球菌菌落。 　　1.3.3 实验分组 将24例离体牙根尖样本随机分为8组，即SEM观察1、2、7 d组和对照组，CLSM观察1、2、7 d组和对照组，每组3颗。实验组浸泡于粪肠球菌ATCC 29212菌液中（37 ℃，厌氧环境），采用连续培养法，每2 d用新鲜的CDC液体更换菌液，建立根尖生物膜模型。分别于培养1、2、7 d取根尖样本，置于无菌EP管中，1 mL PBS缓冲液冲洗3次；对照组样本浸泡于无菌CDC液体培养基中