篦子三尖杉脚6基脚6基焦磷酸合成酶基因克隆与序列分析.docVIP

篦子三尖杉脚6基脚6基焦磷酸合成酶基因克隆与序列分析 　　摘要：三尖杉是我国特有植物，主要含有生物碱、黄酮及萜类等生物活性物质。以篦子三尖杉为试验材料，根据同源克隆的方法扩增三尖杉?脚６?基?脚６?基焦磷酸合酶（GGPPS）基因，并通过生物信息的方法对该基因进行鉴定和分析。结果表明，篦子三尖杉GGPPS基因全长1 217 bp，含有1个完整的1 182 bp开放阅读框（ORF），编码393个氨基酸的蛋白序列，GGPPS蛋白相对分子量为43.042 ku，理论等电点（pI）为6.57，其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成；蛋白质同源分析表明，三尖杉GGPPS含有多聚异戊二烯基合成酶家族中保守的5个特征性结构和2个富含天冬氨酸的区域；同源模建分析显示，三尖杉GGPPS具有GGPPS蛋白典型的三维结构，特别与薄荷GGPPS蛋白的三维结构及活性位点极其相似；系统进化分析表明，三尖杉GGPPS蛋白归属植物进化支，且与加拿大红豆杉、曼地亚红豆杉、海南粗榧的GGPPS蛋白归为同一分支。 　　关键词：篦子三尖杉；萜类化合物；?脚６?基?脚６?基焦磷酸合酶（GGPPS）；克隆；序列分析；同源模建；系统进化 　　中图分类号： S188；Q785 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0079-04 　　萜类化合物是植物代谢中数量最多的一类代谢物，以异戊二烯为结构单元，在植物的光合作用、呼吸作用、生长、发育、繁殖、信号转导和防御中发挥重要作用。植物中存在的某些萜类具有重要的经济价值和药用价值，如红豆杉（Taxus）中的二萜紫杉醇[1]、银杏（Ginkgo biloba）中的二萜银杏内酯和倍半萜白果内酯[2-3]、青蒿（Artemisia annua）中的倍半萜青蒿素[4]等。三尖杉属（Cephalotaxus）植物主要含有生物碱、黄酮类化学成分，其中的三尖杉酯类生物碱由于具有明显的抗癌活性得到了深入研究，关于黄酮类成分的研究较少。除此之外还含有一些萜类化合物，如二萜类的海松酸、柳杉酚等，初步研究表明，该类化合物对微生物有抑制作用[5]。?脚６?基?脚６?基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）是包括紫杉醇、银杏内酯、海松酸、柳杉酚在内的所有二萜类化合物的共同前体，由?脚６?基?脚６?基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）催化，通过类异戊二烯合成途径生成。在该反应途径中，GGPPS催化15 C的法呢基焦磷酸（farnesylpyrophosphate，FPP）与5 C的异戊烯焦磷酸（isopentenylallyl diphosphate，IPP）缩合生成GGPP[6-7]。因此，GGPPS是红豆杉植物合成紫杉醇、银杏合成银杏内酯、三尖杉属植物合成海松酸和柳杉酚的关键酶之一。在三尖杉中克隆该基因并分析其序列的结构特征和进化模式，将为后续的功能研究和基因工程、代谢工程等技术手段大量获得有用产物奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　1.1.1 植物材料 篦子三尖杉（Cephalotaxus oliveri）摘采于中国科学院武汉植物园，取其嫩叶立即置于液氮中保存备用。 　　1.1.2 主要分子生物学试剂 普通Taq DNA聚合酶、高保真 LA Taq 酶、dNTP等试剂，购自TaKaRa；DNA凝胶纯化回收试剂盒，购于Axygen生物技术有限公司。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 篦子三尖杉GGPPS基因的克隆 　　 引物的设计 用加拿大红豆杉 （Taxus canadensis） GGPPS蛋白（登录号：AADl6018）作为查询序列，进行Blastp相似性搜索，在三尖杉属植物海南粗榧（C. hainanensis）中得到1条同目标序列相似性较高的序列 （登录号：GBHQ10039.1）。根据这条序列设计3对特异引物（分别位于中部和左右端部），详见表1。 　　 篦子三尖杉GGPPS基因的分段扩增 以提取的篦子三尖杉总DNA为模板，分别以F1-1、R1-2，F2-1、R2-2，F3-1、R3-2为引物进行PCR扩增。扩增体系为25 μL，包含2.5 μL 10×PCR buffer（Mg2+ plus），2 μL dNTP混合物（每种2.5 mmol/L），各1 μL引物（10 μmol/L），0.5 μL Ex-Taq（2 U/μL），1 μL DNA模板（25 ng/μL），补加17 μL的水。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，36个循环；72 ℃延伸8 min。 　　PCR结束后，进行DNA琼