脊髓背角小胶质细胞儿茶酚抑素与神经病理痛关系研究.docVIP

脊髓背角小胶质细胞儿茶酚抑素与神经病理痛关系研究 　　摘要：目的：探讨脊髓背角小胶质细胞儿茶酚抑素与神经病理痛的关系。方法：雌性 SD 大鼠 20只， 随机分为坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）神经病理痛组和对照组。通过坐骨神经慢性压迫性损伤（CCI）神经病理痛组大鼠模型Catestatin 处理（全身应用）组CCI 大鼠模型和对照组等大鼠，结合在及离体实验，综合应用形态学、行为学、分子生物学及电生理学方法，观察大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤大鼠痛行为变化。在细胞水平采用全细胞膜片钳技术研究Catestatin 和 P2X4 嘌呤受体激动剂之间在小胶质细胞的相互影响。同时采用RNAi 技术，设计并筛选出针对Catestatin 基因的有效 siRNA，采用鞘内注射给药途径将 siRNA 导入疼痛模型大鼠体内，观察其对神经病理痛模型大鼠的痛行为及P2X4 受体蛋白和 mRNA 表达的作用。结果：与正常组相比，经Catestatin处理的大鼠的机械缩足反射阈值（MWT）明显降低以及热缩足反射潜伏期（TWL）明显缩短。结论：Catestatin与P2X4受体之间有一定的联系即Catestatin可能会使P2X4受体的敏感性增强，从而降低痛阈，提示人们对神经病理痛的治疗有了新靶点。 　　关键词：神经病理痛；儿茶酚抑素；P2X4受体；小胶质细胞 　　疼痛（pain）严重困扰着人类健康，是一个至今尚未完全解释清楚的问题，主要表现为机体对组织损伤或潜在的损伤所产生的一种不愉快的主观反应，包括痛觉（painperception）和痛反应（pain response）。目前临床上将疼痛作为继体温、脉搏、呼吸、血压等四大生命征之后的第五大生命体征，为生命体征的重要指标，由此说明对疼痛的研究日益受到医学界的广泛重视[1]。本次研究中，神经性疼痛与脊髓疼痛敏感区域小胶质细胞的激活有关，小胶质细胞的激活作用和致炎因子的释放对神经性疼痛的产生非常重要，成为疾病反应和其后病理性疼痛的关键。现将研究结果汇报如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　在建立模型以前，我们先把这些小鼠随机分成四组，每组五只，分别做好标记：头、背、头加尾、右后肢。通过观察 CCI 大鼠痛行为测定痛阈，包括动物机械刺激及热刺激痛觉过敏现象，即测定机械缩足反射阈值（MWT）及热缩足反射潜伏期（TWL），记录下正常小鼠的MWT和TWL，以与实验组的数据作比较。 　　1.2 方法 　　1.2.2 动物行为学方法 　　观察CCI大鼠痛行为（测定痛阈）：测定CCI实验各组（假手术对照组、神经病理痛模型组、Catestatin处理神经病理痛模型组和Catestatin的siRNA处理神经病理痛模型组）动物机械刺激及热刺激痛觉过敏现象，即测定机械缩足反射阈值（MWT）及热缩足反射潜伏期（TWL），并进行比较。另观察大鼠伤害性行为反应：测定鞘内单纯应用Catestatin组、鞘内应用Catestatin后足底注射P2X4嘌呤受体激动剂组及鞘内应用生理盐水足底注射P2X4嘌呤受体激动剂组动物伤害性反应，并进行比较。 　　1.2.3 RNAi技术本项目采用RNAi技术，设计并筛选出如下针对Catestatin基因的有效siRNA，采用鞘内注射给药途径将siRNA导入神经病理痛模型大鼠体内，通过行为学方法观察其对大鼠痛行为的作用，并结合分子生物学方法检测正常对照组、假手术组、CCI组、CCI+生理盐水组、CCI+Catestatin siRNA组实验大鼠背根神经节以及脊髓背角小胶质细胞中P2X4受体蛋白和mRNA的变化，分析与Catestatin 的siRNA作用的相关性。Catestatin基因的有效siRNA：Sense：5-CAACAACAACACAGCACUdTdT-3 Antisense：5-AGCUGCUGUGUUGUUGUUGdTdT-3 　　1.2.4 免疫组织化学反应（1）用免疫荧光双重染色标记方法观察L4-L6腰膨大段脊髓背角细胞Catestatin和胶质细胞特异性活性标志物OX-42的表达，以证实Catestatin来自小胶质细胞。（2）先用兔抗Catestatin（1：500，Santa Cruz Biotechnology）及生物素标记羊抗兔IgG二抗血清（Catestatin，1：200，Vector， Burlingame）进行抗生物素-生物素-辣根过氧化酶（ABC）免疫组化法反应，DAB呈色。然后进行免疫细胞化学观察L4-L6段脊髓背角小胶质细胞Catestatin的表达。（3）免疫组化反应结果用Image-Pro Plus图像分析系统观察分析反应密度。比较各组大鼠L4-L6腰膨大段脊髓背角小胶质细胞Catestatin免疫组化（荧光）反应结果