吡非尼酮抑制眼眶成纤维细胞应力纤维及粘着斑重构作用和细胞功能的实验研究-临床医学专业论文.docx

万方数据 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。 保密 ，在 年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密 。 （请在相对应的方框内打“√” ） 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名 ： 日期： 年 月 日 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 第一部分 眼外肌来源成纤维细胞的原代培养、鉴定及诱导分化 目的：研究TAO眼外肌来源的成纤维细胞，在TGF-β1作用下的细胞生长分化状 态。 方法：通过组织块培养法收集TAO眼外肌来源的成纤维细胞，进行细胞形态及免 疫标记物鉴定为成纤维细胞；通过MTT法观察成纤维细胞在不同浓度TGF-β1 （1μg/L、5μg/L、10μg/L）诱导后的增殖效应；通过免疫细胞化学法检测成纤维 细胞表达α-SMA；通过Western检测不同浓度（1μg/L、5μg/L、10μg/L）和时间 （24h、48h、72h）效应下，TGF-β1诱导成纤维细胞表达α-SMA水平。 结果：⑴原代和传代培养的细胞呈长梭形，胞浆丰满，核呈圆形或椭圆形，核仁 清晰，细胞融合后呈放射状、漩涡状排列紧密；免疫细胞化学染色显示：vimentin 阳性表达，Desmin、Kerati、S-100、第Ⅷ因子呈阴性反应，可以鉴定TAO组和正 常对照组眼外肌标本培养的细胞为成纤维细胞。⑵MTT法检测TGF-β1诱导72h 后的成纤维细胞增殖率具有剂量效应，10μg/L TGF-β1组细胞增殖率最高，为 107.35%（P﹤0.05）；TAO组和正常对照组的成纤维细胞MTT光密度值比较， 差别不具有统计学意义（P﹥0.05）。⑶10μg/L TGF-β1处理24h，成纤维细胞胞 浆丰满，体型增大，细胞足突增多；免疫细胞化学染色显示胞浆内大量α-SMA 表达，强阳性染色；阴性处理组细胞内表达α-SMA量少。⑷ Western-blot检测 TGF-β1诱导成纤维细胞表达α-SMA蛋白具有剂量和时间效应，10μg/L TGF-β1处 理48h具有最大表达量（P﹤0.05）；TAO组和正常对照组的成纤维细胞α-SMA 蛋白表达量相互比较，差别不具有统计学意义（P﹥0.05）。 结论：利用组织块贴壁法培养的成纤维细胞的形态学和免疫学特征明显，可用 于甲状腺相关眼病的体外研究对象。TGF-β1 具有促进成纤维细胞增殖和向肌纤 维母细胞分化作用，其诱导的 α-SMA 表达水平增高在一定范围内具有浓度和时 间依赖性。 第二部分 吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖、分化、迁移及收缩功能的 实验研究 I  目的：研究吡非尼酮对 TAO 眼外肌成纤维细胞的增殖、分化、迁移和收缩胶原 作用的影响。 方法：在不同浓度 TGF-β1、吡非尼酮、地塞米松作用下，通过 MTT 法检测成纤 维细胞增殖作用，台盼蓝染色法检测细胞存活状态。在 10μg/L TGF-β1、1.0mg/ml 吡非尼酮、1000nM 地塞米松作用下，利用划痕实验检测细胞迁移作用，免疫细 胞化学法检测细胞表达 α-SMA、fibronectin 的作用，以及凝胶收缩实验检测细胞 收缩胶原的作用。 结果：⑴MTT 法检测吡非尼酮抑制成纤维细胞增殖率具有剂量效应，0.5mg/ml、 1.0mg/ml 吡非尼酮的 72h 细胞增殖率，分别为-24.82%、-41.84%，二者 MTT 值 与空白对照组比较，P﹤0.05；吡非尼酮较地塞米松具有更强的抑制 TGF-β1 诱 导的细胞增殖作用（P﹤0.05）。⑵台盼蓝染色法观察不同浓度吡非尼酮作用 72h 后，成纤维细胞活性良好，未见明显细胞毒性作用。⑶细胞划痕实验显示，TGF-β1 具有促进细胞迁移和融合效应；吡非尼酮抑制细胞迁移作用明显（P﹤0.05）。 ⑷免疫细胞化学染色显示，吡非尼酮作用 72h 后成纤维细胞内无明显 α-SMA 表 达；地塞米松组成纤维细胞内正常表达 α-SMA。空白对照组、TGF-β1 组、地塞 米松组 72h 后均可见 fibronectin 在成纤维细胞内外高表达，并聚合成互相连接的 纤维网状结