苯丙氨酸羟化酶基因新突变的体外表达研究-儿科学专业论文.docxVIP

上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 - - PAGE 12 - 1 材料与方法 试剂 含人类全长 PAH cDNA 的质粒 pcDNA3.0； 首都儿科研究所 非洲绿猴肾细胞 COS-7； 中国科学院 氨苄青霉素 碧云天； LB 粉 碧云天； 琼脂粉 碧云天； E.coli Competent Cells DH5α TaKaRa; QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit Stratagene; Lipofectamine? LTX and PLUS? Reagents Invitrogen; 质粒小量提取试剂盒（离心柱型） TIANGEN； 无内毒素质粒大提试剂盒（离心柱型） TIANGEN； PAH MaxPab mouse polyclonal antibody Abnova; BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型) 碧云天； 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG (H+L) 碧云天； SDS凝胶配制试剂盒 碧云天； SYBR? Premix Ex TaqTM II （Perfect Real Time） TaKaRa； PrimeScript? RT reagent Kit TaKaRa； Total RNA 提取试剂 TaKaRa； 彩色预染 marker 碧云天； DMEM Gibco； 胰酶 Gibco； PBS 粉 Sigma； 其它试剂均为国产分析纯。突变引物由上海生工生物公司合成。样品测序由 六合华大基因有限公司完成。Real Time PCR 所用引物由 TaKaRa 公司设计上海生 工生物公司合成。 仪器 梯度 PCR 仪 ABI veriti； 低温离心机 Eppendorf 5810R 低温高速离心机 HighTechi SCR20BA RealTime PCR systerm ABI 7500 荧光倒置显微镜 OLYMPUS IX50 凝胶成像仪 Bio-RAD 低速离心机 上海安亭 TGL-16B 恒温摇床 Qilinbeier TS-8 电热恒温水槽 上海精宏 DK-600 电热恒温培养箱 上海佑柯 DNP-9082 DY-A 电泳仪 上海生化所 聚丙烯酰胺凝胶电泳仪 TANON EPS300 酶标仪 Thermo Scientific，USA 电子分析天平 HANGPING 超净工作台 苏净集团安泰公司 串联质谱仪 API2000(美国) 1.3 常用试剂配制 （1） LB 液体培养基（1000mL） 配制每升 LB 液体培养基,在 950 mL 去离子水中加入:LB 粉（胰蛋白胨 10 g, 酵母提取物 5 g,NaCl 10 g）。摇动容器直至溶质溶解。用 5mol/L NaOH 调 pH 至 7.4(该 pH 适合原核表达菌种 E.coli 的生长)。用去离子水定容至 1L.在高压下 蒸汽灭菌 20 min。置于 4℃冰箱保存 （2） LB 固体培养基（1000mL） ①配制每升 LB 固体培养基,在 950 mL 去离子水中加入:LB 粉（胰蛋白胨 10 g,酵母提取物 5 g,NaCl 10 g），再加入琼脂粉 7.5 g。摇动容器直至溶质溶解。 用去离子水定容至 1L.在高压下蒸汽灭菌 20 min。 ②抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的 LB 固体培养基置于 55℃的水浴中， 待培养基温度降到 55℃时加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充 分摇匀。 ③倒板：10mL 倒 1 个板。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照 10- 15 min。 ④保存：用封口胶封边，并倒置放于 4℃冰箱保存，一个月内使用。 （3）Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15 g Tris 碱，44 g 甘氨酸，5 g SDS，加水 1000 mL。 (4)转膜缓冲液：2.9 g 甘氨酸，5.8 g Tris 碱，0.37 g SDS,200 mL 甲醇，定容 至 1000mL. 对象 7 例 PKU 病人均经本科诊治，经 DNA 序列分析确定了基因型，其中 6 种突变 R270G, P275A, F121L, A156P, E183G 和 I324N 均为错义突变，是由本实验室检出并在国际 首次报道，R408Q 为已报道的突变（表 1）。 病例 1，男，6 月，诊断：HPA。患儿初筛血 Phe:6 mg/dL。血串联质谱检测:Phe:486 μmol/L,tyr:27μmol/L,Phe/Tyr：17.3。DHPR 正常，尿蝶呤正常。华夏奶粉治疗 后血 Phe 浓度控制不佳10 mg/dL,患儿头发黄，抽搐。 病例 2，女，6 月，诊断：BH4 反应性 HPA。患儿初筛血 Phe:320μmol/L。 Phe 负荷试验（μmol/L）