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黄精多糖柱前衍生化HPLC指纹图谱研究 　　摘要：为了建立黄精多糖组成糖的指纹图谱，采用柱前衍生化HPLC法测定黄精多糖的组成，并建立其组成糖的指纹图谱。色谱柱为Agilent ZORBAX XDB C18色谱柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），以0.025 mol/L磷酸盐缓冲液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）-乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速为0.8 mL/min，柱温为40 ℃，检测波长为250 nm。结果显示，黄精多糖有4个共有峰，分别为甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖，对10批样品进行相似度分析，其相似度大于0.98。采用HPLC法建立多糖的指纹图谱操作简便、选择性高、分析速度快，可有效检测黄精多糖。 　　关键词：黄精多糖；柱前衍生化；高效液相色谱；指纹图谱 　　中图分类号：O657.7+2；R282.7l 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）13-3462-03 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.049 　　中药材黄精又名老虎姜、鸡头参、玉竹，始载于《名医别录》，是百合科（Liliaceae）黄精属（Polygonatum）滇黄精（Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl）、黄精（Polygonatum sibiricum Red.）或多花黄精（Polygonatum cyrtonema Hua）的干燥茎根[1]。黄精的主要活性成分是黄精多糖，现代药理学研究结果表明，黄精多糖具有降低血糖、血脂，抗病毒，延缓衰老，增强机体免疫功能等作用[2-6]。中国是生产植物提取物的大国，但目前提取物市场还比较混乱，建立黄精多糖的特征图谱，有利于黄精多糖质量管理的规范。多糖中决定其活性的因素主要有组成糖、分支度、糖苷键的连接方式等，其中，组成糖测定比较简单、可控。故选择采用柱前衍生化的方法测定黄精多糖的组成，并建立其指纹图谱。此方法操作简便、重现性好，可作为评价黄精多糖质量的手段之一。 　　1 材料与方法 　　1.1 样品与试剂 　　黄精，购自超市，由长春中医药大学中药教研室鉴定；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和三氟乙酸（TFA）均购自国药集团化学试剂有限公司，其他试剂为分析纯，水为超纯水。甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖（Gal）、半乳糖醛酸（GalA）、木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）、鼠李糖（Rha）、岩藻糖（Fuc）均购自Sigma公司，纯度均99%以上。 　　1.2 仪器与设备 　　Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；AB204-N型分析天平，Mettler-Toledo仪器上海有限公司。 　　1.3 色谱条件 　　色谱柱Agilent ZORBAX XDB C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）；以0.025 mol/L磷酸盐缓冲液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）-乙腈（85∶15，V/V）为流动相A，以0.025 mol/L磷酸盐缓冲液（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）-乙腈（60∶40，V/V）为流动相B。梯度洗脱比例为0 min-10 min-30 min-0 min，B为0%-8%-30%-0%；流速为0.8 mL/min；柱温为40 ℃；检测波长为250 nm；进样量5 μL。 　　1.4 对照品溶液制备 　　取葡萄糖等9种单糖各2 mg，置螺帽试管中，分别加2 mL水溶解，加入0.3 mol/L NaOH溶液 1 mL，再加入0.5 mol/L PMP甲醇溶液1.2 mL，混匀，密封，置70 ℃水浴中反应30 min，取出，冷却至室温，加入0.3 mol/L HCl溶液调节pH至中性，混匀，用等体积氯仿萃取3次，取水层，吹干，残渣加 2 mL甲醇溶解，取续滤液，作为对照品溶液。 　　1.5 供试品溶液制备[7] 　　1.5.1 黄精多糖的提取 称取黄精饮片200 g，加入8倍量的水进行煎煮，每次2 h，煎煮3次，过滤，合并水提液，浓缩至一定体积，向其中缓慢加入无水乙醇至乙醇浓度为80%，静止过夜，离心，弃去上清液，沉淀挥干法去掉乙醇，冻干，即得黄精多糖。 　　1.5.2 黄精多糖的酸水解 精确称取黄精多糖 5 mg，置螺帽试管中，加入2 mol/L TFA溶液2 mL，混匀，密封，置100 ℃烘箱中水解8 h，吹干，残渣加1 mL甲醇，吹干以除去多余的TFA，反复3次，残渣加2 mL水溶解，即得黄精多糖酸水解溶液。 　　1.5.3 PMP衍生化 将黄精多糖酸水解溶液中加