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黄瓜CMV复制酶基因相对表达定量PCR方法建立 　　摘要：为了对黄瓜感染CMV植株体内CMV复制酶基因表达水平进行测定，建立CMV复制酶基因的相对表达定量检测技术。并用该方法开展黄瓜植株CMV抗性鉴定试验，以18S rRNA基因为对照。CMV复制酶基因为目标基因，设计引物，探索SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系，同时对CMV复制酶基因进行均一化处理，利用荧光阈值(O值)计算p－防御素基因的相对表达量。结果表明：利用SYBR Green I实时荧光定量PCR技术测定黄瓜CMV复制酶基因相对表达定量具有较高的准确性，耗时短，该技术可应用于CMV抗性植株的筛选。 　　关键词：实时荧光定量PCR；CMV复制酶基因；相对表达量；黄瓜 　　 　　　黄瓜花叶病毒(Cucumeer，mosaic virus，CMV)在分类上属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridate)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)，是黄瓜病毒病的主要毒源。它的寄主范围很广，能浸染85科365属的1000多种单双子叶植物，主要依靠蚜虫传毒。目前通过采用常规化学药剂防治病毒病效果不明显，因此，培育抗病毒病品种是一种十分有效的防治途径。传统育种在抗病性转育过程中，需要在人工接种后，根据表型用目测法进行抗病性鉴定，不但费时、费力、转育效率低，而且存在因鉴定的误差容易使目标性状丢失等问题。因此，建立CMV复制酶基因相对表达量的测定方法，以便高效快捷筛选出抗性目标植株。同时对研究抗性分子学机理也是非常必要的。 　　实时荧光定量PCR是最近几年发展起来的新技术，是在常规PCR基础上把荧光共振能量转移与荧光标记探针结合，巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术融合在一起的一项创造性技术，具有准确、简便、高灵敏度等特点，特别是定量低丰度的mRNA及揭示微小的基因表达变化。该技术不要求扩增后电泳等的处理，可以节省时间，并能有效消除实验室PCR产物如核酸和溴化乙锭等污染。实时荧光定量PCR技术现已广泛应用于生物学、基础医学、法医学、诊断学等多个领域。 　　本研究方法以SYBR Green I实时定量PCR为基础，采用相对标准曲线法检测CMV复制酶基因相对表达量，建立黄瓜CMV复制酶基因相对表达定量检测技术体系，并应用于黄瓜CMV抗性植株的筛选，为进一步进行黄瓜抗病育种研究奠定技术基础。 　　 　　1　材料与方法 　　 　　1.1　接种病毒来源及植物试验材料 　　接种采用的CMV为黄瓜花叶病毒植物冻干粉，购自福建农林大学植物病毒所福州腾龙生物有限公司。取所购CMV植物冻干粉0.5 g加10 mL0.03 mol?L-1磷酸缓冲液(pH值=7.0)匀浆，置于冰上待用。植物材料选用感CMV的黄瓜材料HZL04-1，抗CMV的黄瓜材料F-3，及其F2代群体，培养于光照培养箱(20-25℃)中，以最终获得的189个F2代单株作为试验材料。 　　 　　1.2　接种方法 　　待黄瓜叶片长至2片真叶时，用清水将叶子清洗干净，待水干后均匀撒上少量石英砂，采用摩擦接种方法专人接种CMV。接种1min后用清水轻轻冲洗叶片。3 d后再接种1次。本研究共处理了189份样品用于后续试验。 　　 　　1.3　黄瓜基因组总RNA的制备 　　分别取接种前和感染CMV后的黄瓜叶片提取总RNA，采用RNA prep植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)，按照试剂盒内说明书操作。 　　 　　1.4　PCR引物的设计与合成 　　以烟草18S rRNA为内参基因，以CMV复制酶基因为目标基因，使用Primer Express 3.0软件设计2对引物，序列见表1。引物由上海生工生物技术有限公司合成。 　　 　　1.5　cDNA反转录 　　cDNA反转录采用随机引物进行。PCR反应体系(20uL)如下：RNA 2.0uL；first-strand buffer(5*)4.0uL；dNTP(2.5 mmol?L-1)2.0uL；随机引物(10uM)2.0uL；Rnasin(40 U?uL-1)0.5 uL；M-MLV(200U?uL-1)1.0uL。 　　 　　1.6　实时荧光定量PCR反应 　　以反转录合成的cDNA为模板同时对目的基因(CMV复制酶基因)和内参基因(18S rRNA)荧光定量PCR扩增。PCR反应体系为20 uL，其中2倍的SYBR Green Master Mix(ABI)10uL，正向引物和反向引物(10umol?L-1)0.4uL，cDNA模板1uL，用灭菌去离子水补至20uL。 　　实时荧光定量PCR在Step One Plus(ABI)荧光定量PCR仪上进行。反应程序为95℃10min；95℃15 s，60℃1 min，40个循