基因诊断与基因治疗教学课件.ppt

恶性肿瘤 恶性肿瘤的基因治疗包括：针对癌基因表达的各种基因沉默、针对抑癌基因的基因增补、针对肿瘤免疫反应的细胞因子基因导入和针对肿瘤血管生成的基因失活等等。 遗传性疾病 腺苷脱氨酶（ADA）缺陷病 病 因 ADA缺陷→重症联合免疫缺陷症 （SCID） ????? 治疗靶细胞 骨髓干细胞 ???? 治疗载体 逆转录病毒 人类历史上第一种应用基因治疗的疾病 1. 单基因遗传病的基因治疗 只受一对等位基因影响而发生的疾病属于单基因遗传病，设计基因治疗方案相对容易，例如镰刀状红细胞性贫血、α-地中海贫血、血友病等。基本方案是通过一定的方法把正常的基因导入到病人体内，表达出正常的功能蛋白。 2.针对多基因病的基因治疗 由多个基因相互作用结果，并受环境因素影响而发生的疾病属于多基因病，如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等。 展望 从实验室到临床,逐步走向成熟,是一个极有希望和发展前景的领域 存在的问题 缺乏高效特异的基因导入系统 缺乏调控基因表达的方式 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 三、基因治疗中基因导入的方法 载体：病毒载体和非病毒载体 (一) 非病毒导入法 物理方法 直接注射 基因枪法 电穿孔法 化学方法 磷酸钙共沉淀法 脂质体转染法 DEAE葡聚糖法 直接注射法 将含有裸DNA（质粒）的溶液直接注射入肌肉组织 ● 优点 可持续表达几个月至一年 无毒无害,操作简便 ● 缺点 仅限于在肌肉组织 需要注射大量的DNA 转入效率低 基因枪法 又称为生物弹道技术(biolistic technology)或微粒轰击技术(particle bombardment technology). 原理 采用微粒加速装置,使裹着外源基因的微米级的金或钨颗粒获得足够的能量后,直接进入靶细胞或组织. 优点 操作简便,DNA用量少,效率高,无痛苦,适宜在体 缺点 不易于内脏器官的在体操作 电穿孔法 用高压脉冲电场在细胞膜上打孔。 化学法 磷酸钙共沉淀法 脂质体转染法 DEAE葡聚糖法 （二）病毒载体导入法 病毒的特点： 靶细胞定向感染性 宿主细胞寄生性 基因治疗中的病毒载体： 反转录病毒载体 腺病毒载体 腺相关病毒载体 单纯疱疹病毒载体 病毒载体的基因转移效率较高，是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。 常用病毒载体结构 反转录病毒的结构及生活周期 （1）反转录病毒 两端各有一长末端重复序列LTR。 反转录病毒前病毒的结构特点 LTR由U3、R和U5三部分组成。 病毒有三个结构基因 5ˊ端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（ψ）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。 含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。 在U3内有增强子和启动子； U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； 在R内还有poly(A)加尾信号。 gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； pol基因，编码反转录酶； env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 Retroviral packaging system 包装细胞(packaging cell) 已经转染和整合缺陷型病毒（辅助病毒）基因组。表达gag 、pol 和 env编码蛋白。本身不产生病毒颗粒。 反转录病毒的制备 反转录病毒载体介导的基因治疗流程 治疗基因克隆到反转录病毒载体中 筛选包装细胞 转化细胞培养 从上清中获得重组病毒颗粒并纯化之 感染靶细胞 反转录病毒载体的优缺点 优点 基因转移效率高 细胞宿主范围广泛 DNA整合效率高 缺点 1 安全性问题 会重组产生有感染性病毒的可能 随机整合