大肠杆菌可溶性表达抗TNF-αFab的工艺优化-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（９）：３１３７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 技术与方法 檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 大肠杆菌可溶性表达抗ＴＮＦＦａｂ的工艺优化 α １，２ ２ ２ １ １，２ ２ １ 张宇萌 　童　梅 　陆小冬 　米　月 　莫　婷 　刘金毅 　姚文兵 （１中国药科大学生命科学与技术学院　南京　２１０００９　２北京三元基因药业股份有限公司　北京　１０２６００） 摘要　目的：通过构建抗ＴＮＦ Ｆａｂ重组表达质粒，在大肠杆菌周质空间中高效可溶性表达抗 α ＴＮＦＦａｂ，经工艺优化以提高目的蛋白的产率。方法：菌体经发酵罐发酵后，使用萃取方法进行 α 周质空间可溶性目的蛋白的萃取并通过试验设计（ＤＯＥ）优化萃取工艺，采用ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔ Ｆｌｏｗ强碱性阴离子交换柱净化，ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ疏水柱及ＰｒｏｔｅｉｎＬ亲和柱纯化。结果： 经ＤＯＥ筛选得到了相对最优的萃取条件，该纯化方法得到的目的蛋白的体积产率可达２３．５ｍｇ／Ｌ， 纯度大于９０％，回收率大于２４％，且离子交换柱净化过程有效地保护了亲和柱，提高了亲和柱的 使用寿命。抗体亲和力检测证明抗ＴＮＦＦａｂ具有良好的生物学活性。结论：通过萃取工艺及纯 α 化方法的优化，为抗ＴＮＦＦａｂ的进一步工艺放大及目的蛋白的性质研究奠定了基础。 α 关键词　大肠杆菌　ＴＮＦ　Ｆａｂ　ＤＯＥ　溶液萃取　疏水作用层析　ＰｒｏｔｅｉｎＬ α 中图分类号　Ｑ８１６ 　　类风湿性关节炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ，ＲＡ）是一种 表达系统相比真核细胞表达系统具有成本低廉、大规 自身免疫性疾病，表现为外周关节的慢性、非特异性炎 模发酵容易、条件易于自动化控制等优点，通过大肠杆 ［３４］ 症反应，ＲＡ是一种高致残性疾病，约５０％的患者在发 菌表达重组蛋白是一种高效、经济的途径 。大肠杆 病两年内出现骨关节破坏症状，最终导致关节畸形和 菌周质空间中蛋白酶含量低、杂蛋白含量少，因此 Ｆａｂ 功能丧失。组织内高水平的炎性细胞因子参与了ＲＡ 在周质空间中的表达有利于分离纯化和减少蛋白酶对 病情的发生和发展，其中关键因子为肿瘤坏死因子 α 目的蛋白的降解。经传统的破菌方法得到的菌体提取 （ＴＮＦ），它介导了炎症及滑膜组织增生等病理过程。 物往往含有大量杂蛋白及核酸类物质，给分离纯化带 α 因此抑制ＴＮＦ可起到控制炎症、阻断病情发展的作 来了困难，本实验探究了较为温和的溶液萃取方法，试 α 用。目前已经上市的用于中和ＴＮＦ的单克隆抗体有 图减少胞内蛋白的释放，并通过优化萃取方案提高Ｆａｂ α ［５６］ 产率 。亲和层析介质 ＰｒｏｔｅｉｎＬ对抗体 轻链上的 英夫利昔、依那西普、阿达木单抗、戈利木单抗和赛妥 κ