哺乳动物转基因技术的研究.docVIP

哺乳动物转基因技术的研究 　　摘要介绍了转基因哺乳动物的研究概况，综述了哺乳动物转基因技术基本方法，外源基因的整合和表达，转基因哺乳动物的检测方法以及哺乳动物转基因技术的应用和存在的问题。 　　关键词转基因哺乳动物；外源基因；转基因技术 　　中图分类号Q953+.5文献标识码A文章编号 1007-5739（2009）06-0196-03、、 　　 　　20世纪70年代开创的DNA重组技术已被广泛的应用在生命科学的各个研究领域，并取得了丰硕的研究成果。转基因哺乳动物自20世纪80年代初诞生以来，一直是生命科学研究和讨论的热点，随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，转基因技术得到了广泛的应用。转基因技术是20世纪遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第4代技术，是生物学领域发展史上126年中14个转折点之一。 　　 　　1转基因哺乳动物的研究概况 　　 　　1980年Gordon等首先采用受精卵原核注射方法，将疱疹病毒基因SV40DNA片段和PBR322原核DNA分别注射到小鼠受精卵的雄原核内，移植受体后获得了相应的转基因小鼠。1982年Palmiter等又将带有小鼠MT启动子的大鼠生长激素基因（rGH）导入小鼠受精卵，得到了21只小鼠，其中7只带有目的基因，有6/7的小鼠比同窝对照组生长快近2倍，这些快速生长的转基因小鼠被誉为“超级小鼠”（super mouse），表明整合了的外源基因可以在宿主体内得到有效正确表达，表达产物可以在宿主动物体内行使正常的功能。 　　自此便掀起了培育转基因动物的大潮，按照研究转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊及转基因牛都陆续育成。特别是1997年英国罗斯林研究所克隆羊“多莉”的诞生，突破了有性生殖的框架，表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖。同年美国PPL公司和罗斯林研究所合作，利用该法生产出具乳腺表达人第九因子的绵羊[1]。 　　利用转基因克隆技术获得了克隆猪、体内含有外源基因的转基因猪、体内有2个基因被“关闭”了的转基因克隆猪和基本不含人体免疫排斥基因的“基因敲除”克隆猪等[2]。 　　我国从1984年开始转基因动物研究，并于同年最先获得了含人B2珠蛋白基因的转基因小鼠。1985年和1986年又分别获得了含人生长激素（MT2hGH）基因的转基因泥鳅和小鼠。1987年获得含有大肠杆菌galk和gpt基因的转基因小鼠。以后又相继获得了含HbgAg乙型肝炎表面抗原基因的转基因兔、转基因猪、含EPO基因和人乙型肝炎表面抗原基因2种乳腺特异性表达的转基因山羊、含人凝血因子IX的转基因山羊、含人血清白蛋白基因的转基因奶牛、含“生物钢”蛋白基因的转基因老鼠[3]。 　　 　　2哺乳动物转基因技术基本方法 　　 　　2.1物理方法 　　主要包括显微注射法、电激法、超声波法、冻融法、基因枪法等，其中以显微注射法使用最为广泛，多数转基因动物是通过该方法获得的。显微注射法是用微吸管在显微操作仪下将一定量的外源基因直接注入到受精卵的雄原核中，将受精卵培养后移植给受体动物。1980年Gordon将SV40的TK基因整合后的质粒以显微注射法注入小鼠受精卵原核中，首次成功地培育出转基因小鼠，随后利用该方法，转基因兔、猪、绵羊、鱼、牛和山羊也都相继获得成功。这种方法的优点是：外源基因易整合入染色体，导入的基因大，可使用任何载体承载基因片段，也可注射无载体的基因片段，外源基因的长度不受限制，可达100Kb，实验周期相对比较短。但这一技术还存在明显不足，由于基因整体进入染色体的随机性，使外源基因整合位点和拷贝数无法控制，需要昂贵精密的设备，操作复杂，需培训专门技术人员。尽管如此，由于其直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。 　　2.2化学方法 　　主要包括磷酸钙沉淀法、多聚阳离子试剂法、脂质体包埋法和DEAE-葡聚糖法。目前，脂质体包埋法是最佳的选择。脂质体是由双分子层组成的闭合囊泡，通过细胞的内吞作用，将所携带的目标基因导入细胞中。自Felgner等（1987）首次用DOTMA/DOPE阳离子脂质体介导基因转染培养细胞成功以来，取得较大进展，通过此方法获得了转基因山羊、绵羊、牛[4]。该方法效率很高，离体细胞可以瞬时表达外源基因，但其作用机理尚未完全阐明。Kawaura等（1998）发现，抑制细胞内吞的物质（如细胞松驰素）可最大程度地抑制转染，说明转染机制可能是细胞内吞。该技术的优越性表现在细胞毒性低，对外源基因片段大小无特殊要求，且脂质体易于制备，尤其是免疫原性低，可在体内转染时使用与体外实验相同的载体。目前，面临的主要问题是转染靶向性不强，易被吞噬细胞清除，血清的抑制作用以及转化效率低等。 　　2.3生物方法