茶树被茶尺蠖取食诱导的HPL基因克隆、功能鉴定与表达特征研究-遗传学专业论文.docxVIP

Ⅰ Ⅰ 摘 要 C6 挥发物是植物对害虫进行间接防御的关键物质之一，而植物体内的脂氢过氧 化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）是其合成的关键酶。而有关茶树 HPL 基因 及其与害虫取食间的关系至今未见报道。论文在本课题组前期建立的茶树被茶尺蠖取 食诱导前后的 cDNA 消减杂交文库（SSH）中获得一条与 HPL 同源性很高的 EST （GenBank：GW342656）基础上，对茶树 HPL 基因进行了 cDNA 全长克隆、功能鉴 定、及其被茶尺蠖取食诱导的表达特征分析。主要结果如下： （1） 利用 3’/5’-RACE 技术从茶树叶片中克隆了一条编码 HPL 的 cDNA 全长， 其序列长度为 1662 bp，从起始密码子开始有 5 个开放阅读框（ORF），其中最长的 ORF 编码含 491 个氨基酸的蛋白质，并命名为 CsHPL（GenBank：HM440156），其 理论分子量和 PI 分别为 54.88kD 和 8.02，多序列同源比对分析发现其与番石榴的 13-HPL（AF239670）同源性最高，为 71%；蛋白质保守功能结构域预测分析表明， CsHPL 含有细胞色素 P450 家族中高度保守的 4 个结构域 A、B、C 和 D，且结构域 A( I 螺旋区)中保守的苏氨酸被异亮氨酸所代替，结构域 D 中高度保守的半胱氨酸残 基附近有一些特殊的序列 NKQAA；进化树分析表明，CsHPL 与番石榴的 13-HPL 等 同在一起属于 CYP74B 亚类。 （2）原核表达分析表明，CsHPL 基因表达的蛋白分布于上清和包涵体中，结果 产生了分子量约为 60kD；体外酶促反应结果显示，原核表达的 CsHPL 只催化 13-HPOT 底物，而对 9-HPOT 不表现活性，因此属于 13-HPL 类型；原核表达的 CsHPL 最适温 度为 25℃，最适 pH 值为 7.0。对 CsHPL 基因的 5 个不同 ORF(Met1, Met5, Met8, Met9 和 Met15)全部进行了原核表达，结果发现它们各自表达的蛋白都具有 HPL 活性。 （3）利用 GC-MS 对原核表达的 CsHPL 催化产物进行了鉴定，结果表明其将底 物 13-HPOT 催化生成的 C6 挥发物为(z)-3-己烯醛。 （4）Southern blot 分析表明，CsHPL 基因以单拷贝存在与茶树基因组中。 （5）qRT-PCR 分析表明，两个茶树品种龙井 43 和舒茶早被茶尺蠖取食后 3-9 h， CsHPL 基因表达量能够明显上升，且达到最大表达量，随后下降，但是其最大表达 量和出现的时间存在品种间差异；龙井 43 在取食后 3 h CsHPL 基因表达量上升至最 大值，为对照的 13.6 倍，而舒茶早则在 9 h 时表达量最大，为对照的 3.9 倍。对两个 品种进行机械损伤后，CsHPL 基因的表达呈现类似的规律。 关键词：茶树, 茶尺蠖, 脂氢过氧化物裂解酶, 基因克隆, 功能鉴定 I II Abstract C6-Volatile is one of the key material which is indirect defense against pests in the plants, fatty acid hydroperoxide lyase is a key enzyme in its synthesis in plants. However, it hasn’t been reported that HPL gene of tea and the relationship between HPL gene and insect feeding. The EST fragment of hydroperoxide lyase (HPL) was screened form SSH library of tea induced by Ectropis oblique feeding. On this basis, research molecular cloning, functional identification and expression characteristic of the HPL gene from Camillia sinesis induced by Ectropis oblique feeding. The main results are as follows: A full-length cDNA of HPL was first obtained by 3’/5’-RACE (rapid amplification of cDNA ends) technique