微生物学实验教学细菌的革兰氏染色经典法和三步法的比较与分析.docVIP

微生物学实验教学一- 色经典法和三步法的比较与分析 吴红萍王醜宋晶靂金映虹 海南师范大学生命科学学院 对革兰氏染色经典法和三步法进行了试验比较，发现革兰氏染色三步法过程简 单、效果好、成功率高。操作过程中，只需控制好菌龄14[6h，复红乙醇脱色染 色时间大于60s等关键步骤，初学革兰氏染色学生实验的成功率高达87. 5%。革 兰氏染色三步法具有良好的技术稳定性和可操作性，有利于提高学生实验技能 和增强学生实验自信心，可在细菌革兰氏染色实验教学中推广使用。 关键词： 革兰氏染色;经典法;三步法;实验教学;比较分析; 吴红萍（1982一），男，硕士，实验师，主耍从事实验室管理工作、 环境微生物资源开发与应用研究工作。 金映虹（1982—），女，硕士，实验师，主要从事实验室管理工作、 微生物资源开发与应用研允工作。 2017-03-09 基金：2015年度海南师范大学生命科学学院本科生实验教学创新项目“革兰氏 染色经典法和三步法的比较分析”（项目编号:Skysyjxxm03） Received： 2017-03-09 革兰氏染色法是以丹麦病理学家Hans Christian Joachim Gram的名字命名的， 是微生物染色技术中十分重要的方法。革兰氏染色法自1884年发明以来，100 多年来一直被延用，是不可缺少的细菌检验技术之一，常用于细菌的分类和鉴 定IU。革兰氏染色法可以将细菌分成革兰氏阳性（G）和革兰氏阴性（G）两种 类型，是由两种细胞壁结果和组成的差异所决定的。革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚 糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身不结合染料，但其所具有的网孔结 构可以滞留碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保存原有的蓝紫色。而革兰氏 阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂 质溶解，细胞壁通透性增加，原来滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗 脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后乂变为复染剂颜色（红色） 革兰氏染色经典法，即四步法。主要包括草酸铵结晶紫染液初染、卢哥氏碘液媒 染、乙醇脱色及番红复染四大步骤。革兰氏染色三步法，是山西省屮医研究所黄 元桐教授在Allen氏对Zichl-Ncclcn抗酸菌染色法改进的启示下而研宄的一种 新染色方法，包括草酸铵结晶紫初染、卢哥氏碘液媒染和复红酒精混合液脱色复 染三大步骤［3］。 革兰氏染色法作为微生物实验教学中重要内容之一，是每个学生必须掌握的实 验操作技术。但革兰氏染色经典法的实验教学屮，学生对革兰氏染色最关键的步 骤乙醇脱色掌握不好，耍么脱色过度产生假阴性结果，耍么脱色不够产生假阳 性结果，导致学生重复制片，既浪费时间乂看不到好的结果，严重打击了学生 的实验积极性［4, 5］。为改进微生物学实验一细菌的革兰氏染色实验教学效果， 提高学生对革兰氏染色实验的积极性，我们将革兰氏染色经典法和三步法的菌 龄、涂片质量和脱色时间等实验过程关键步骤进行了精细化的控制，并对试验结 果进行了分析，旨在为三步法在细菌革兰氏染色实验教学应用奠定基础，为后 期该实验教学的改革提供可靠依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1培养基 牛肉膏蛋白胨固体培养基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、Na Cl 5g、琼脂15-20g、水 1000m L、p H 7. 2-7. 4。121°C灭菌 20min。 1. 1.2菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,实验室保存。 1.1.3染色剂 革兰氏染色经典法用染色液:革兰氏染色套装（广东环凯微生物科技有限公 司）、革兰氏染色三步法用染色液:按 配制Mil。 1.1.4其他器材 普通光学显微镜（BA210,麦克奥迪实业集团有限公司）、移液枪、接种环、酒 精灯、载玻片、染色架、洗瓶等。 1.2方法1.2.1染色过程 革兰氏染色法（经典法和三步法）方法和步骤 进行［2］。 图1革兰氏染色法（经典法和三步法）流程示意图 1.2.2质量控制 革兰氏染色用菌种一般需处于对数生长期，该期间的细胞组分及形态、生理特征 基本一致，经革兰氏染色液处理后，均能正确反应染色结果。若菌体细胞未成熟 或老化，其染色结果可能呈现假阳性和假阴性的情况。取培养10h、14h、16h、 18h、20h的菌种培养物进行革兰氏染色观察，每种菌龄制片染色重复4次。 1.2.2. 2涂片质量 取新培养的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别制成细菌悬液。将洁 净玻片罝于实验桌上，用移液枪吸取1 Pl菌悬液于玻片上，涂成直径广1. 5cm 的圆形涂片，自然晾干或用吹风机冷风于玻片背面吹干M。 1.2.2. 3脱色时间 经典法脱色