高强度聚焦超声制备DC瘤苗及其免疫作用的实验研究-老年医学专业论文.docxVIP

X X 1015972 高强度聚焦超声制备DC瘤苗及其免疫作用的实验研究 硕士生：刘丽霞 专 业：老年医学 指导教师：叶欣教授 中文摘要 目的①应用高强度聚焦超声mi曲intensity focused ultrasound，HIFU)辐照肿瘤细 胞获取肿瘤抗原并致敏树突状细胞(dendritic cell，DC)，制备DC肿瘤疫苗。观察此方 法制各的DC瘤苗免疫小鼠后机体产生的抗肿瘤主动免疫保护作用。②为应用DC介导 的肿瘤免疫预防和治疗开辟新途径。③为HIFU开辟新的应用领域。 方法①应用10ng／ml的粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte—macrophage colony stimulating factor，GM·CSn和10ng／ml的白介素·4(interleukin-4，IL一4)联合 诱导培养小鼠骨髓细胞，光镜和电镜观察DC发育过程中形态学变化；流式细胞术检 测DC表面分子CD80、CD86、H．2Kd及I—A4的表达情况。②应用不同剂量的HIFU辐 照体外培养的CT-26肿瘤细胞后，用胎盼兰染色测定活细胞数、观察细胞的形态学变 化；MTT法分析HIFU剂量与肿瘤细胞存活率的关系，从而找出制备肿瘤抗原的工作 剂量。③用剂量为t000W／cm2×30s的HIFU辐照体外培养的BALB／c小鼠CT-26结肠 癌细胞，获取肿瘤抗原，与体外培养扩增第5天的DC共孵育，制备DC瘤苗。④DC 瘤苗的体内主动免疫保护作用：H／FU辐照法制备的DC瘤苗(HIFu组)一次性免疫正 常BALB／c小鼠(5×105／只，含25叽l RPMll640)，7天后再皮下接种对数生长期的 CT-26结肠癌细胞(5×105／X)，然后观察肿瘤发生时间、20天时肿瘤重量和肿瘤体积 及小鼠生存时间、生存率等。并与反复冻融法制备的DC瘤苗(冻融组)和等量RPMll640 (阴性对照组)进行比较。 结果①用GM．CSF和IL．4联合培养小鼠骨髓细胞3天后，可见细胞形态发生改 变，细胞形态不规则，并呈簇生长。培养第6--8天，细胞表面出现较多毛刺样突起， 拉长，为典型的DC特征。流式细胞仪检测，DC高表达CD80、CD86、H一2Ko及I-Ad 等。②应用不同剂量的HIFU辐照CT-26细胞，随着剂量的增加肿瘤细胞的存活率迅 速减少，肿瘤细胞的碎片逐渐增多。超声剂量为1000W／cm2×30 S时，细胞全部死亡， 失去细胞形态并全部被撕裂成碎片。因此，选用1000、Wcm2×30 失去细胞形态并全部被撕裂成碎片。因此，选用1000、Wcm2×30 S作为制备肿瘤细胞 裂解液(肿瘤细胞抗原)的工作剂量。③HIFC组、冻融组分别与阴性对照组比较肿瘤 发生时间、20天肿瘤重量、体积等差异均有显著性意义(PO．01或P0．05)；HIFU组 与冻融组比较，肿瘤重量及体积差异亦均有显著性意义(尸o．05)；HIFU组、冻融组 分别和阴性对照组小鼠生存时间中位数分别是32．5天、28．5天和24．5天，三组之间生 存率比较，z 2-----22．35，P0．Ol，差异具有显著性意义。说明HIFU辐照法和反复冻融 法制备的DC瘤苗都能抵抗肿瘤的生长，具有主动免疫保护作用，而且前者有优于后 者的趋势。 结论①联合应用GM．CSF和IL-4培养小鼠骨髓细胞，可大量扩增成熟DC，培 养的DC符合其自身的特性。(g)HIFU能灭活肿瘤细胞且能破碎肿瘤细胞，1000W／cm2 ×30s可作为制备肿瘤细胞裂解液(肿瘤细胞抗原)的工作剂量。此方法获取的肿瘤全 细胞抗原可有效地致敏DC，制备DC瘤苗。@HIFU辐照法制备的DC瘤苗可以使机 体产生抗肿瘤的主动免疫作用，有效抵抗肿瘤的攻击，具有明显的肿瘤预防作用。 关键词树突状细胞；高强度聚焦超声；超声剂量；肿瘤抗原；肿瘤疫苗；主动免 疫 A A STUDY oF MAKING DC TUMoR VACCINE BY HlGH INTENSITY FoCUSED UL，I．RASoUND AND oBSERⅥNG ITS IMMUNoPRoTECIVE EFFECT POSTGRADUATE：Liu lixia SPECIALITY：Gerontology TUTOR ：Pro．Ye Xin ABSTRACT Objective①To make tumor antigen by high intensity focused ultrasound(HIFU)irradiating and use this antigen to load DC．at last produce DC tumor vaccine．And investigate the active anti- Rlmor inmlunopro