海马mu型阿片肽受体介导癫痫发作敏感性形成机制研究-生理学专业论文.docxVIP

海马mu型阿片肽受体介导癫痫发作 海马mu型阿片肽受体介导癫痫发作 敏感性形成机制研究 博士研究生： 刘辉 指导教师： 张万琴教授 指导小组： 马郁芳教授 专业名称： 生理学 摘 要 l。 f 【颞叶癫瘸在所有成人癫痫中的预后最差，60—70％将发展为难治 性癫痫。颞叶癫痫红藻氨酸(kainic acid，KA)模型具有明确的动态 变化过程，一次全身性给予惊厥剂量(10mg／kg)KA诱发SD大鼠 急性癫痫发作后5．7天，动物开始出现癫痫发作敏感性长期增强，脑 内亦发生与人类颞叶癫瘸相似的神经病理、神经生化及神经分子生 物学方面的改变，因此被认为是研究颞叶癫瘸和难治性癫痫的理想 模型之一。 海马内源性阿片肽及其受体与癫瘸发作机制密切相关。研究表 明，脑啡肽(enkephalin，ENK)及其mu型阿片肽受体(mu．opioid receptors，MORs)具有促进癫痫发作作用。KA模型癫痫发作敏感动 物海马内的ENK水平长期增加．提示ENK可能参与了KA介导的癫 痫发作敏感性形成过程，但尚缺乏直接证据。本研究采用颞叶癫痫 KA模型，通过海马内注射MORs的激动剂PL017和拮抗剂B．FNA 探讨MORs介导癫瘸发作敏感性形成作用及机制。 皮下注射惊厥剂量(10mg／kg)的KA制备颞叶癫瘸模型的癫瘸 发作敏感大鼠，采用微渗透泵技术分别将生理盐水(NS)、PL017和 B．FNA连续7天恒速注入清醒自由活动的上述动物的腹侧海马内。7 B．FNA连续7天恒速注入清醒自由活动的上述动物的腹侧海马内。7 天后皮下注射阈下剂量(5mg／kg)KA检测癫痫发作敏感性形成情况。 然后应用原位杂交技术观察大鼠海马内NMDA受体2B亚单位 (NR2B)表达的变化；应用免疫组化方法观察大鼠海马内GABA、 神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)、诱导型NOS(iNOS)、 微管相关蛋白．2(MAP一2)和0【．微管蛋白(cc．tubulin)的变化。 结果显示，一次给予惊厥剂量KA后7天，KA+NS组的癫痫发 作敏感性形成；MORs激动剂组(KA+PL017)动物出现癫瘸发作敏 感性增强；与上述两组比较，MORs拮抗剂组(KA+[3．FNA)动物癫 痫发作敏感性明显降低(pO．01)，p．FNA以剂量依赖方式延长癫痫 发作的潜伏期、降低发作级别。 原位杂交和免疫组化结果表明，KA后7天，癫痼发作敏感大鼠 (KA+NS)海马齿状回颗粒细胞(DGCs)层和门区NR2B mRNA表 达增加(pO．01)：GABA样免疫反应神经元、2型nNOS样神经元 及eNOS样神经元数目和染色强度下降(pO．0I)；正常海马内未见 iNOS样免疫反应，而KA+NS组在海马DGCs层和海马门区出现 iNOS样免疫反应神经元：MAP．2和c【．tubulin样免疫反应有部分缺失 现象，但DGCs层、门区和CA3／4腔隙层的总体反应增加(p0．01)。 KA+PL017组上述指标变化与KA+NS组一致并有所加强。海马注射 MORs拮抗剂p—FNA可明显取消癫瘸发作敏感动物的上述各种改变： 与KA+NS和KA+PL017组比较，DGCs和门区NR2B mRNA表达显 著下调(pO．01)，而与空白对照组相似(pO．05)；GABA样免疫反 应活性明显增加(pO．01)，但仍低于空白对照组(pO．05)；2型nNOS 及eNOS样免疫反应神经元数目增加，染色增强(p0．01)，而iNOS 样免疫反应明显减轻(pO．01)；CAl／2区辐射层、CA314区腔隙层 及DGCs层和门区MAP．2和d-tubulin样免疫反应显著减弱(p0．01)。 以上结果提示，海马MORs对KA诱导的癫瘸发作敏感性形成有 以上结果提示，海马MORs对KA诱导的癫瘸发作敏感性形成有 介导作用。NMDA受体表达上调、iNOS水平增加以及GABA、nNOS 和eNOS水平降低可能与MORs介导癫瘸发作敏感性形成机制有关： 而MAP．2和仪．tubulin水平的增加可能通过促进苔状纤维发芽参与癫 痫发作敏感性的长期维持过程。 发病机制研究是指导治疗策略和药物开发的根本，因此几个抗癫 痫新药的作用靶点，如兴奋性和抑制性氨基酸及其受体、自由基、 一氧化氮及神经可塑性改变等已受到极大关注。我们以往研究表明， 蝎毒(scorpion venom，SV)能够调整脑内兴奋性和抑制性氨基酸、 阿片肽等神经递质和／或调质水平及胶质细胞功能，早期给药可以防 止癫瘸发作敏感性形成，晚期给药(即癫痫发作敏感性形成后给药) 也有治疗作用。但由于毒性作用的存在，SV的开发利用受到限制。 为此，本研究观察了特殊工艺处理后SV的急性毒性变化及其抗急性 癫瘸发作活性，并对处理后的SV组分进行初步分离与纯化