基质硬度对正常人类肝(LO2)细胞内自噬体分布的影响的研究-生物化工专业论文.docxVIP

本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下独立进 行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。 本人已完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文版权使用授权的说明 本学位论文作者完全了解 常州大学 有关保留、使用学位论文 的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属常 州大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分 内容，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于保密范围，在 年解密后适 用本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本 授权书。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 导师签名： 签字日期： 年 月 日 中 文 摘 要 在各个器官中，细胞周围都是柔软的组织，而不是玻璃，塑料那 样硬的表面，但是几乎所有的关于细胞的实验都是在玻璃，塑料表面 进行的，然而细胞外基质硬度会对细胞产生很大的影响。它能刺激肿 瘤的形成，肝癌的形成就是一个很好地例子，由于肝纤维化和肝硬化 使得正常肝组织慢慢变硬从而促进了肝癌的发展。此外，自噬在肝脏 疾病中也扮演着重要的角色，研究发现肝癌细胞系与正常细胞系相比 较而言自噬水平降低了，暗示自噬在肿瘤的中起到抑制的作用，然而 在肿瘤的发展过程中细胞外基质硬度是否会影响自噬还不清楚。 因为LC3-II的含量与自噬体相关，而且LC3-II出现在自噬过程的 各个阶段，所以选取LC3作为自噬的标记蛋白，但是有研究表明LC3 是一种很容易聚集的蛋白，瞬时转染的暂时性过表达容易引起LC3的 聚集，所以构建了能稳定表达自噬标记蛋白LC3的LO2稳定细胞系是 必要的。为了研究基底硬度与自噬的关系，我们构建了能稳定表达自 噬标记蛋白LC3的LO2稳定细胞系。我们采用一种相比于传统方法更 方便，高效的方法，将瞬时转染后的细胞按照2000/孔，1000/孔，500/ 孔的比例种到96孔板中筛选15天，成功构建了4株稳定表达自噬标记 蛋白GFP-LC3 LO2单克隆稳定细胞系，选择其中GFP-LC3表达量最高 的一株进行后期的实验。 通过改变固化剂和聚二甲硅氧烷（PDMS）的比例，我们制备出 了11 kPa，124 kPa，1220 kPa三种硬度的PDMS基底，将LO2细胞培 养在这三种硬度的基底和塑料表面（作为对照）48小时，接下来用荧 光显微镜观察细胞中自噬体的位置，用免疫印迹法分析LC3-II的表达 量，结果显示不管是24小时还是48小时，LC3-II的表达量并没有显著 地差异，所以我们推断基质硬度对自噬水平的影响并不大，然而不同 硬度的基底却对LO2细胞中自噬体的分布影响很大，更具体些，在软 的基底上（11 kPa PDMS基底）培养48小时的LO2细胞中的自噬体在 细胞核周围聚集成一个球状，而硬的基底（1220 kPa PDMS基底）或 是塑料基底上的细胞中的自噬体仍然是分散在细胞质中，我们的结果 显示基底硬度影响自噬不是通过直接增加自噬水平，而是通过影响细 胞中自噬体的分布，这些发现将为以自噬为目标的癌症治疗提供一些 新的思路。 关键词：肝细胞；自噬体；基质硬度；分布；肝纤维化 ABSTRACT Majority of cells in multicellular organisms are embedded in normally soft extracellular matrix (ECM) rather than placed on stiff glass/plastic surfaces as they are examined in most in vitro studies. In contrast, the ECM often becomes stiffer during tumor development, which not only gives the tumors hardness feel but also actively contributes to the tumor formation. A good example is hepatocellular carcinoma (HCC) that usually develops within chronically stiffened liver tissues due to fibrosis or cirrhosis. On the other hand, the reduction