基质金属蛋白酶-9在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的表达-神经病学专业论文.docxVIP

浙江大学硕士学位论文基质金属蛋白酶一9在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的表达 浙江大学硕士学位论文 基质金属蛋白酶一9在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的表达 硕士研究生 王海峰 导 师 黄鉴致主任医师 浙江大学医学院 神经病学专业 中文摘要 目的 探讨基质金属蛋白酶一9(Matrix metalloproteinase一9，㈣P一9)在多发性 硬化(Multidle Sclerosis，MS)的动物模型一一实验性自身免疫性脑脊髓炎 (experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠的脑脊髓中的表达 和作用。 EAE是由CD4+T淋巴细胞介导的，阻中枢神经系统脱髓鞘、血脑屏障 (blood—brain barrier，BBB)破坏及脑脊髓实质和血管周围单核淋巴细胞浸润 为特征的实验动物的自身免疫性疾病，国外多采用Lewis大鼠作为研究对象，目 前己被公认是研究多发性硬化的理想动物模型。基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases，删Ps)是一类肽链内切酶，包括胶原酶类、明胶酶类、间质 溶解素类等等。已有研究表明此类酶家族具有破坏血脑屏障，降解细胞外基质 (extraeellular matrix，ECM)，以及降解髓鞘碱性蛋白的作用。 国外学者研究发现中枢神经系统的小胶质细胞、星型胶质细胞、血管内皮以 及T细胞、巨噬细胞可分泌MMPs，而且在EAE模型及MS的病灶及周围有埘Ps 的表达上升，尤其是明胶酶类的删P一9。本实验采用EAE非敏感品系Wistar大 鼠建立EAE模型，并检测MMP一9在此模型脑脊髓中的表达，以阐明利用Wistar 大鼠建立EAE模型的可行性，同时探讨^n仰一9在EAE发病中的作用。 材料和方法 1、实验动物、试剂及仪器：雌性Wistar大鼠，体重180—2209：雌性豚鼠，体 重250—3509。Wistar大鼠随机分为EAE模型组、完全福氏佐剂(completeFreund，s 喇tivant，CFA)组及生理盐水(NS)组共3组。山羊抗大鼠蛳P一9抗体、兔抗山 羊sP试剂盒、完全福氏佐剂等试剂以及超声细胞粉碎仪、石蜡包块切片机、显 微镜等仪器已备。 2、建立EAE模型：应用豚鼠脑脊髓匀浆作为抗原与CFA混匀于Wistar大鼠颈背 辑江大学硕士学垃论文部皮下注射0．4ml，辅以百日咳杆菌原液(含1×1010个菌)背部皮内注射诱导 辑江大学硕士学垃论文 部皮下注射0．4ml，辅以百日咳杆菌原液(含1×1010个菌)背部皮内注射诱导 建立EAE模型，同时CFA组及NS组于皮下分别注射CFA(O．4m1)、NS(O．4m1) 作为对照组。并在首次抗原注射后第9天予以10％豚鼠脊髓匀浆(guinea pig spinal—cord homogenate，GPSCH)或NS皮下注射，在第12天观察迟发性变态反 应结果。 3、采用免疫组化方法检测发病后3天内、6-8天、2周不同时间段EAE大鼠组(评 分2—3分)脑脊髓中．ⅧP一9的表达，并与CFA组及Ns对照组的检测结果比较。 结果 l、利用豚鼠脑脊髓匀浆加上CFA、百日咳杆菌原液的注射方法成功诱导了Wistar 大鼠的EAE模型。EAE发病率29．5％，发病时间多在抗原免疫后第8—12天， 反应病情严重程度的第14天平均临床症状评分1．94±0．87，而单纯CFA、NS 注射组无动物发病。第12天观察皮试结果显示EAE组皮丘直径大于CFA组及 NS组，结果有统计学差异。HE及Weil髓鞘染色显示EAE大鼠脑脊髓血管周围 单核淋巴样细胞浸润性炎症及脱髓鞘改变。 2、删P一9半定量免疫组化分析显示EAE大鼠脑脊髓内有特异的眦P一9的表达。 发病≤3天在脑脊髓白质内浸润的单核淋巴样细胞，以及细胞外间质、脑脊髓膜、 室管膜及脑脊髓小血管壁上有较多阳性删P一9表达。而发病后6—8天阳性单核 淋巴样细胞明显减少，血管及间质N咿一9表达下降。而CFA及Ns组仅少量MMP 一9表达。统计分析显示不同组别、不同病程阶段删P一9表达有统计学差异。 发病≤3天的删P一9表达高于发病后6—8天(PO。05)及发病后2周(P0．01)。 结论 l、采用EAE非敏感品系Wistar大鼠成功建立EAE模型，但wistar大鼠发病率低于 国外文献报道Lewis大鼠的发病率。同时从病理角度揭示EAE有类似于Ms的表现， 即存在血管周围淋巴样细胞浸润以及脱髓鞘改变。 2、EAE大鼠脑脊髓的脑脊膜、单核淋巴样细胞有特异的删P一9的表达，且发病 早期删P一9阳性细胞率高于发病后期、恢复期及对照组，结果有统计学差异， 提示ⅢP一9与EAE发病有关，可能参与EAE发病。对EAE发病机理的深入研究 将有助于对许多神经系统自身免疫相关疾病的发