DNA重组和克隆的科学操作.pptVIP

2 DNA重组的单元操作 基因工程载体必需具备的4个基本条件 具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一限制性内切酶位点。 具有合适的选择标记基因。 2.1 DNA重组的载体 2.1.1 质粒载体 一、质粒的一般生物学特性 2、可扩增性 3、质粒的不相容性 4、质粒的转移性 二、理想质粒载体的必备条件 （一）天然质粒用做载体的局限性 （二）理想质粒载体的必备条件 三、质粒载体的构建 （一）pBR322质粒载体的构建 四、常用的质粒载体 （一）克隆质粒载体 （二）表达质粒载体 （三）多功能质粒载体 （四）穿梭载体 2.1.2 λ双链噬菌体DNA载体 一、 λ噬菌体的生物学特性 （三） λ噬菌体的DNA复制 二、构建λ噬菌体载体的基本原理 λ噬菌体的改造 （二）构建λ噬菌体载体的基本内容 三、常用的λ噬菌体载体 （一）插入型载体 （二）取代型载体 2.1.3 M13单链噬菌体DNA载体 一、M13噬菌体的生物学特性 （一） M13噬菌体的基因组结构 （二） M13噬菌体复制、感染和包装 一、黏粒载体的基本特点 2.1.5 人造染色体载体 2.2 DNA的体外重组（切和接） 一、限制性核酸内切酶 （二）限制性核酸内切酶的类型 （三）限制性核酸内切酶的命名 （四）II类限制性核酸内切酶的基本特性 1. II类限制性内切酶的识别序列 2. II型限制性核酸内切酶的切割方式 （五）甲基化酶的基本特征 2.2.2 DNA连接酶 一、概念和机理 二、DNA连接酶的种类 （一）T4噬菌体DNA连接酶 2.2.3其他用于DNA重组的工具酶 一、大肠杆菌DNA聚合酶I 二、Klenow片段 2.2.3.2 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT） TdT 作用的底物性质 2.2.3.3 S1核酸酶 2.2.3.4 Bal31核酸酶 2.2.3.5 T4噬菌体多核苷酸激酶 一、T4噬菌体多核苷酸激酶的性质 1、正向反应 2、交换反应 2.2.3.6 碱性磷酸酶 一、碱性磷酸酶的性质 三、T4-DNA聚合酶 2.2.4 DNA切接反应的影响因素 2.2.4.1 限制性核酸内切酶的切割反应 2.2.4.3 重组率及其影响因素 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ + 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ 3′ 5′ + 超螺旋DNA a b c Bal31 Bal31 Bal31 Bal31 Bal31 带有约5个核苷酸的单链尾（80%-90%） 平端（10%-20%） 带有约5个核苷酸的单链尾（80%-90%） 平端（10%-20%） 是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，已在多种哺乳动物中发现了多核苷酸激酶。 （一）激酶活性 T4噬菌体多核苷酸激酶可催化ATP的γ－磷酸基团转移到单链或双链DNA或RNA5′-OH末端。其中包括两种反应：正向反应和交换反应。 正向反应即催化5′-OH末端的磷酸化。反应需Mg 2+ ，加入DTT可提高酶活性，pH6.5-8.5。 T4噬菌体多核苷酸激酶催化5′突出末端磷酸化的速度比催化平端或5′凹陷末端磷酸化快得多。 3′ 5′ 3′ 5′ T4噬菌体多核苷酸激酶、 OH OH 3′ 5′ 3′ 5′ *P *P C – G – C - OH 5′ 3′ *ATP T4噬菌体多核苷酸激酶 *ATP C – G – C - *P +ADP 图2-16 T4噬菌体多核苷酸激酶的正向反应活性 单链或双链DNA或RNA 是指在过量ADP存在时，DNA的5′磷酸转移给ADP，然后DNA从γ-32P-ATP中获得标记的γ-32P ，重新磷酸化。反应需Mg 2+ ，pH6.2-6.6，效率低于正向反应。 反应底物是带有5′磷酸末端的单链或双链DNA或RNA，其中含有5′磷酸末端的单链DNA得到标记的效率最高。 3′ 5′ 3′ 5′ T4噬菌体多核苷酸激酶、 P P 3′ 5′ 3′ 5′ *P *P C – G – C - P 5′ 3′ *ATP T4噬菌体多核苷酸激酶 *ATP C – G – C - *P +ADP+ATP 图2-16 T4噬菌体多核苷酸激酶的正向反应活性 单链或双链DNA或RNA 过量ADP 过量ADP 细菌碱性磷酸酶 小牛肠碱性磷酸酶 作用：可去除DNA或RNA5′末端的磷酸 。 二、碱性磷酸酶的用途 （一） 5′末端标记前的处理 在使用多核苷酸激酶进行5′末端标记前，用碱性磷酸酶去除DNA或RNA 5′磷酸，可得到较高的标记效率。 （二）去除DNA片段的5′磷酸基团，防止