毛囊器官培养模型的应用研究及含毛囊人工皮肤的研制-皮肤病与性病学专业毕业论文.docx

浙江大学2004届硕士学位论文毛囊器官培养模型的应用研究与含毛囊人工皮肤的 浙江大学2004届硕士学位论文 毛囊器官培养模型的应用研究与含毛囊人工皮肤的 研制+ 浙江大学医学院 皮肤性病学 硕士研究生 吴贤杰 导 师 郑敏吕中法 目的 建立小鼠触须游离器官培养模型，并用该模型研究不同浓度他克莫司(FK506) 对小鼠触须游离毛囊器官培养的生物学特性影响：用阿糖胞苷(Ara—c)结合小鼠 触须游离毛囊器官培养模型建立化疗药物引起毛囊损伤的离体模型：再用该离体 模型研究FKS06与米诺环素(minocycline)对Ara-c引起的毛囊损伤的保护作用。 采用体外培养的乳鼠背部皮肤毛囊球部细胞植入支架，试图建立含毛囊或毛囊样 结构的人工皮肤替代物。 材料与方法 (一)动物来源C57BL／6J近交系小鼠，周龄4～6周：C57BL／6J近交系乳 基金项H：浙江科技厅科技计划重点项日(2003C23012)和浙江省I!生厅科研基金(7002ZX034) 1 浙江大学2004届硕士学位论文鼠，出生4d，均由浙江大学实验动物中心提供。 浙江大学2004届硕士学位论文 鼠，出生4d，均由浙江大学实验动物中心提供。 (二)实验方法 l、小鼠触须游离毛囊器官培养模型的建立： 用显微解剖的方法分离得小鼠触须毛囊，用wnl ams’E无血清培养液进行 游离毛囊器官培养，并与以DMEM为主要成分的常规培养液培养的游离毛囊进行 比较。观察两种方法培养对毛囊尘氏速度，毛囊总生长长度的影响。 2、FK506对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性的研究： 用我们建立的小鼠触须游离毛囊器官培养模型，我们观察了不同浓度FK506 对小鼠触须毛囊体外生长速度、总生长长度、体外生长维持时问等生物学指标做 了观察，同时用3H-TdR掺入法检测了FK506对毛囊DNA合成的影响。 3、Ara—C引起毛囊损伤离体模型的建立： 用我们建立的小鼠触须游离毛囊器官培养模型，我们观察了Ara—C处理4h 后小鼠触须毛囊体外生长速度、总生长长度、体外生长维持时间等生物学指标的 改变；并用3H—TdR掺入法检测了Ara—C对毛囊DNA合成的抑制情况。 4、FK506对Ara—C引起的离体毛囊损伤的保护及逆转作用： 用我们建立的Ara—C引起毛囊损伤离体模型进行研究。分别在暴露Ara C 前2h或暴露Ara-c后4h开始向培养液内加入FK506，观察了FK506对用Ara—C 处理4h后的小鼠触须毛囊体外生长速度、总生长长度、体外生长维持时间等生 物学指标抑制的干预作用；并用3H-TdR掺入法检测了FK506对由Ara—C引起的 毛囊DNA合成抑制的干预作用。 5、米诺环素对Ara—C引起的离体毛囊损伤的保护作用： 用我们建立的Ara-c引起毛囊损伤离体模型进行研究。在暴露Ara—C前2h 开始向培养液内加入米诺环素，观察了米诺环素对Ara～C处理4h后的小鼠触须 毛囊体外生长速度、总生长长度、体外生长维持时间等生物学指标抑制的干预作 用。用两步酶消化法(O．5％分离酶，0．2％I型胶原酶)分离得出生4d乳鼠背 部皮肤毛囊球部细胞，进行体外培养。MTT法检测米诺环素对Ara—c处理4h后 毛囊球部细胞存活率降低的干预作用。 6、毛囊球部细胞体外在胶原／壳聚糖多孔支架上形成含毛囊皮肤样结构的研 究： 用滴加法或注射法将体外培养的C57BL／6J近交系乳鼠背部皮肤毛囊球部细 浙江大学2004届硕士学位论文胞以不同传代数，不同细胞密度接种至胶原／壳聚糖多孔支架，倒置显微镜下观 浙江大学2004届硕士学位论文 胞以不同传代数，不同细胞密度接种至胶原／壳聚糖多孔支架，倒置显微镜下观 察支架表面或浅层细胞的生长或毛囊形成状况。将支架经lO％甲醛固定后作HE 染色检奇，观察支架表面及内部细胞的分布形态，并用免疫组织化学法检测高、 低分子角蛋白及Vimenti n的表达。用共聚焦激光扫描显微镜观察支架内活细胞 群f生k，以及形成毛囊或毛囊样结构的形成。 结果 l、小鼠触须游离毛囊器官培养模型的建立 显微解剖的方法分离得小鼠触须毛囊，用Ⅳi lltams’E无血清培养液(添加 牛胰岛素lOmg／L、氢化考的松10 u g／L、HEPES lOmmol几、亚硒酸钠10 u g／L、 转铁蛋白lOmg／t、青霉素IOOU／L、链霉素100 u g／L等)培养可以成功建立小鼠 触须游离毛囊器官培养模型。离体培养的小鼠触须毛囊生长主要集中在前3～4 天，以后毛囊生长速度明显减慢。用williaffis’E无血清培养液培养的毛囊前 4d生长速度，总生长长度，体外生长维持时间等指标均优于常规培养液培养的 毛囊(PO．05)。 2、FK506对小鼠触须毛囊体外培养生物学特性的研究 0．01～O．3 mg／L浓度的FK