PLAG1及IGF-2、IGF-1R在涎腺多形性腺瘤中的表达及意义.docVIP

贵阳医学院2014届硕士学位论文 cDNA,反应体系如下： 组份 体积（μl） RNA(500ng/μl) 5 50 ng/μl random hexamers 1 10 mM dNTP mix 1 DEPC-treated water 3 总体积 10 瞬时离心混匀，65℃×5min， 后快速置于冰上90s，依次加入下述样品 组份 体积（μl） 10× RT buffer 2 25 mM MgCl2 4 M DTT 2 RNaseOUTTM(40 U/μl) 1 SuperScriptTM III RT (200 U/μl) 1 瞬时离心混匀，进行以下反应 25℃×10min；50℃×50min；85℃×5min， 然后置于冰上待其冷却后，管中加入 1 μl 的RNase H，充分混匀后，37℃×20min。 反应结束后，管中即为样本的cDNA,-20℃保存备用。 引物设计及合成 从Genebank中获取IGF-1R（NM_000875）、IGF-2（NM_000612）和PLAG-1 （NM_002655）的cDNA序列，应用Primer Express软件，根据SYBR Green染 料法的引物设计原则，在各自保守区域设计特异性引物，以β-actin（NM_703909 )作为内参。引物设计资料如下(见表l、2、3)： - 7 - 万方数据 贵阳医学院 2014届硕士学位论文 表 1引物设计资料(1) Tab.1 Primer design information (1) Accession Number Sequence Length Product Length PALG1 7338 75 IGF-2 5182 108 IGF-1R 11242 78 β-actin 1793 85 表 2引物设计资料(2) Tab.2 Primer design information (2) Accession Number Sense Primer （5、-3、） Length Tm PALG1 GAGAGTTACCTGATGGAGTTACA 23 63.2 IGF-2 TAAGCATATCTAAGCAACTACGA 23 61.1 IGF-1R CCTTGATGGTGGAATGAC 18 59.2 β-actin GACTACCTCATGAAGATCCTCACC 24 60.4 表 3引物设计资料(3) Tab.3 Primer design information (3) Accession Number Anti-Sense Primer（5、-3、） Length Tm PALG1 CTTAGATGATGACGATGCTTGAG 23 63.1 IGF-2 CAGTGGAGATGGGAACAG 23 60.9 IGF-1R TGCTCGTAACTCTTCTCT 18 58.6 β-actin TCTCCTTAATGTCACGCACGATT 23 56.6 引物由上海生工生物合成有限公司合成，PLAGl的扩增片断长度 75bp，IGF-2的 扩增片断长度 108bp，IGF-1R的扩增片断长度 78bp，β-actin的扩增片断长度 155bp。 实时荧光定量 PCR 反应体系 组份 体积（μl） cDNA(RT-PCR反应液) 1 引物上游(300nmol/μl) 0.5 - 8 - 万方数据 贵阳医学院2014届硕士学位论文 引物下游(300nmol/μl) 0.5 iQTM SYBR? Green supermix 9 ddH2O 9 总体积 20 反应条件：95℃预变性 30s；95℃变性 10s；59℃退火/延伸 30s，共 39 个循环。扩增结束后，进行熔解曲线分析，起始温度 55℃，终止温度95℃，每 升高0.5℃，保持5s并采集荧光信号，仪器自动生成熔解曲线。每个样品重复3 次。 标准曲线的建立 以对照物 cDNA 为模板，按照上述反应体系和条件分别扩增目的基因以及内 参基因。扩增产物按 10 倍比例进行梯度稀释后，再按照上述反应体系和条件进 行SYBR Green qPCR扩增和荧光强度检测，建立标准曲线，仪器自动计算每个基 因的扩增效率（E）和相关系数（r）。每个梯度设 3个平行样本，每次反应均设 计无模板对照（NTC）,以此排除DNA交叉污染。 标本的检测 按照下表加入各个试剂 组份 体积（μl） cDNA(RT-PCR反应液) 1 引物上游(300nmol/μl) 0.5 引物下游(300nmol/μl) 0.5 iQTM SYBR? Green supermix 9 ddH2O 9 总体积 20 反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火/延伸30s，共39个循环。 扩增