课件：现代医学实验学靶向血管抗肿瘤药物研究方法.ppt

* * * 鸡属卵生动物,胚胎在卵中发育。当卵子由葡萄状的卵巢排出时，正处于减数第二次分裂的中期阶段。然后卵子进入输卵管并下移，如果遇到精子，受到精子入卵的影响，即完成第二次减数分裂，放出第二极体并完成受精，所形成的合子在输卵管中还要经过２４－２７小时的发育。在如此长的时间内，合子已发育到了囊胚阶段甚至原肠胚早期阶段。此时的白色圆盘较大叫做胚盘。在进行上述发育过程的同时，鸡卵由输卵管前部逐渐后移，包上由输卵管分泌蛋白形成的卵白和壳膜，并在子宫内包上钙质壳后排到体外以实验部位边缘1 mm范围内为一级血管,实验部位边缘5 mm处为二级血管,对新生血管进行计数比较可用于促血管新生药物的评价和筛选。 鸡胚有4层胚膜(卵黄囊膜、羊膜、浆膜、尿囊膜)和2套血管网(卵黄囊血管网、尿囊膜浆膜血管网)。鸡胚尿囊出现在孵育的第3．5d，在孵育4～10d．尿囊腔迅速增大至胚外体腔并包围羊膜．以后尿囊外壁与绒毛膜紧贴形成尿囊绒毛膜 中胚层的双层结构由绒毛膜和尿囊膜组成．在这两层中形成丰富的血管网。不成熟的血管散在分布于中胚层．直到第8d形成毛细血管丛．覆盖在绒毛上皮细胞表面。毛细血管快速增殖持续到第11d．此后内皮细胞有丝分裂指数迅速下降．到第18d，血管系统最终形成。鸡胚孵化至第8d时．胚膜和血管网的发育已趋稳定，而机体免疫系统尚未完全建立．此时对各种异物几乎不产生排斥反应．便于观察各种诱导剂和抑制剂对血管生成的影响。 早期鸡胚的血液循环有3条主要路线，即卵黄囊血液循环、尿囊绒毛膜血液循环和胚内循环 。 * * 模型优点：快速、灵敏、简单、廉价。 以新生血管为靶点的抗肿瘤治疗，其优势主要表现在：①肿瘤血管内皮细胞是药物经静脉途径首先到达的部位；② 血管内皮细胞基因状态比较稳定，不易产生耐药性；③ 肿瘤血管内皮细胞的有限损害就可造成大量肿瘤细胞的生长抑制；④抗肿瘤血管治疗具有一定的广谱性；⑤选择性高，对正常组织细胞极少影响。 * * 胚头右下0.5～1cm处开窗。 * * * * * * * * * 在体观察血管发育的模式生物斑马鱼、鸡胚 斑马鱼作为模式生物的特点： 斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87％，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视 ； 斑马鱼的胚胎是透明的，所以生物学家很容易观察到药物对其体内器官的影响 ; 雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因 鸡胚绒毛尿囊膜模型 鸡胚的生物学构造 尿囊 卵黄囊 鸡胚模型的意义 生理情况下．新生血管形成主要发生在胚胎发育和女性月经周期内膜修复过程：在某些病理情况下。如损伤修复、炎症等也常伴发血管生成。特别是肿瘤生长和转移与血管生成密切相关。早在1912年，鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型首次成功用于肿瘤研究。 鸡胚对抑制血管生成的药物较敏感．是一种较理想的研究抗血管形成药物的筛选模型．是研究血管形成和抗血管形成的最佳体内模型之一。 操作过程 获取种蛋，于37℃，55％相对空气湿度下孵育，每天翻动3次； 孵育至第七天，无菌条件下加药： 确定气室及胚头位置 75%酒精清洗卵壳，无菌眼科镊、剪在气室处开窗，直径为2.0cm左右，小心移去蛋壳及其内侧的壳膜，观察绒毛膜尿囊血管生成情况 设置对照组和实验组：对照组加生理盐水，实验组按照预先设定的药物浓度分别加药，药物加在无菌滤纸薄片上，置薄片于血管较细、密度较小部位 小心把对照组和实验组放回温箱， 37℃，55％相对空气湿度，但不再翻动 孵育至第8～10天，连续观察结果并拍照记录。 对照组 高浓度药物实验组 对照组 低浓度药物实验组 中浓度药物实验组 高浓度药物实验组 * 解剖显微镜下以相同放大倍数计数血管，以实验部位边缘(即微孔滤膜载体边缘) 1mm范围内为一级血管，5mm范围内为二级血管．凡属趋向性生长的血管，即以载体为中心发出，与滤膜半径的夹角小于45°者均计数，而穿行，绕行的血管则不计算在内．一、二级血管分别观察计数，然后对一、二级血管数分别进行统计学分析和拍照记录。 注意事项 药物加入时间选择： 鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成大约经历早期、中期和晚期3个阶段。早期胚胎的第5～7天，毛细血管网以出芽的方式形成新生血管；中期胚胎发育的第8～12天，套叠生长是主要的生长方式；而晚期胚胎的第l3～l4天，血管结构已经基本成熟，此时的血管形成主要以毛细血管网的膨胀方式进行。 因此，选择胚胎4～10天进行抗血管形成试验，此时血管形成以出芽和套叠的方式进行，处于血管生长高峰阶段，便于结果的观察。 药物载体的选择： 在CAM 法中，固态待测物可直接加入，液态物质需要适宜载体，使药物在