课件：肿瘤个体化治疗基因检测教程.pptVIP

THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 R10-137 王XX 女 55岁 胃镜标本 不排除腺瘤 检测项目：RRM1 欲做术前介入化疗（吉西他滨）胃镜标本 G10-425 周XX 女 48岁 盐城一院，201010011A 细支气管肺泡腺癌,左上肺结节，肺叶切除 刮片时沿内线刮 生物信息学相关网站 电泳图 用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带。 PCR产物纯化 1.加100μlPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，室温静置10min，12000rpm离心2min。 2.弃收集管内液体，加700μlwashing buffer，12000rpm离心2min。 3.弃收集管内液体，加400μlwashing buffer，12000rpm离心2min。 4.弃收集管内液体，12000rpm离心2min。 5.柱内加30μl70°C预热洗脱液，12000rpm离心2min。 测序反应（以K-ras为例） 反应体系为： BigDye（2.5X） 0.8μl BigDyeSeqBuffer （5X） 1.6 μl Primer 0.3μl PCR纯化产物 1μl ddH2O 6.3μl Total 10μl 测序产物纯化 1.每管加1μlEDTA（125mM）;1μlNaAc（3M）到管里。 2.每管加100μl100%酒精，震荡混匀，室温静置15min。 3.10°C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。 4.每管加100μl70%酒精，5°C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。 5.37°C;30min挥发净酒精，加10μl Hi-Di溶解DNA。 6.95°C；变性5min，4°C；4min，加样上机。 片段分析操作 PCR扩增 加LIZ、HIDI混合变性 上机测序及结果分析 避光 步骤 1多重荧光PCR：15μlPCRmix＋五种（胃肠）或七种（尿）引物0.8μl（其中D17S283加1.2μl）＋1μlDNA.条件：95 °C15min，94 °C1min，56 °C1min，72 °C1min，30个cycle. ２μlPCR产物＋0.4μlLIZ size standard+8μl HiDi,95 °C 5min, 4°C冰冷5min。 上机，分析数据。 Q-PCR操作 RNA提取 Q-PCR仪扩增 结果分析 RT 分光光度计评估质量 详细步骤 1.RT反应:gDNA1μl+RNA 6μl；上机42°C，2min；离心。RT Buffer 2μl，RT酶0.5μl，Primer 0.5μl；上机A64程序。 2.Q-PCR仪扩增 （反应体系） 2×SYBR 2.5μl Primer 1(5uM) 0.5μl Primer 2(5uM) 0.5μl RT产物 1 μl Nuclease-free water 1μl Total 5μl 7900PCR仪反应程序 95°C 10min；95°C 15s；60°C 1min，40cycle。 RQ Manager 1.2软件分析实验数据。 第五章 结果解读及诊断报告出具 基因测序结果分析 RNA表达量结果分析 测序结果图及分析 ABI3100测序仪测序，SeqScape v2.0分析结果为。 以K-ras和E