利拉鲁肽在人骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞中的作用-内科学(内分泌与代谢病学)专业论文.docxVIP

PAGE PAGE 3 利拉鲁肽在人骨髓间充质干细胞诱导分化为 胰岛素分泌细胞中的作用 中文摘要 目的： 研究利拉鲁肽是否具有促进人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）向胰岛素分 泌细胞（IPCs）方向分化作用，确定其最佳诱导浓度和时间，并探讨其可能的作 用机制。 方法： 1、采用高糖、尼克酰胺和利拉鲁肽三阶段诱导方案对体外扩增培养的 P5 代 hBM-MSCs 进行定向诱导分化。具体方案为：先采用含 25mmol/L 葡萄糖的 HG-DMEM 培养基培养 10 天；然后换为添加 10mmol/L 尼克酰胺的 LG-DMEM 培养基培养 7 天；最后向 LG-DMEM 培养基中添加不同浓度（0.1、1、10、20、 50nmol/L）利拉鲁肽，分别刺激 1、3、5、7、9 天。采用 ELISA 法检测利拉鲁 肽作用后各组细胞上清液中的胰岛素含量，以确定其最佳作用浓度和时间。 2、倒置显微镜下观察诱导过程中细胞的形态学变化，并采用双硫腙（DTZ） 染色法鉴定诱导后细胞；采用 Western Blot 检测各诱导阶段细胞 PDX-1、GLUT2、 GK、胰岛素蛋白表达情况；ELISA 检测各诱导阶段细胞的胰岛素分泌水平及细 胞对高糖刺激的反应。 结果： 1、采用 ELISA 检测不同浓度（0.1、1、10、20、50nmol/L）利拉鲁肽刺激 1、3、5、7、9 天后的细胞胰岛素分泌量，确定利拉鲁肽的最佳作用浓度为 10nmol/L，时间为 7 天。 2、诱导前的 hBM-MSCs 形态为长梭形，类似成纤维细胞外观；诱导第一阶 段细胞开始聚集，细胞形态发生改变，部分细胞变圆；第二阶段细胞体积变大、 形态多样，聚集生长更为明显，圆形细胞数量较第一阶段有所增多，并呈半悬浮 状聚集生长；至第三阶段末出现大量圆形葡萄状聚集生长的胰岛样细胞团。 3、诱导前细胞 DTZ 染色阴性，诱导第一阶段末出现少量 DTZ 染色阳性细 胞，阳性率约为 1%；第二阶段末 DTZ 染色阳性细胞量增加，阳性率约为 4%； 第三阶段末细胞 DTZ 染色阳性率约为 8%。 4、诱导前细胞 PDX-1、GLUT2、GK、胰岛素蛋白呈阴性表达；诱导三阶 段细胞 PDX-1、GLUT2、GK、胰岛素蛋白的表达量逐渐增加（P＜0.05）。 5、诱导前细胞上清液中几乎检测不出胰岛素，其含量可忽略不计；诱导三 阶段细胞的胰岛素分泌量逐渐增加，细胞对高糖刺激的反应亦逐渐增加（P＜ 0.05）。 结论： 1、在体外，高糖、尼克酰胺联合利拉鲁肽，可使 hBM-MSCs 定向诱导分化 为 IPCs，并且添加 10nmol/L 利拉鲁肽作用 7 天后可以使其诱导分化率明显增加， 细胞胰岛素分泌量明显增多，诱导后细胞对高糖的反应性亦明显增高，表现出较 成熟的胰岛素分泌细胞特点。 2、诱导第三阶段 PDX-1、GLUT2、GK、胰岛素蛋白的表达量较前两阶段 均明显增加，这从蛋白水平上证实了分化的细胞为胰岛素分泌细胞，并且推断 PDX-1 的表达和活化，激活了下游 GLUT2、GK 等一系列胰岛分化、成熟相关 基因的表达，这是利拉鲁肽促进 hBM-MSCs 向 IPCs 分化及促进分化后细胞成熟 的一个重要机制。 关键词：人骨髓间充质干细胞 高糖 尼克酰胺 利拉鲁肽 诱导 分化 胰岛素分泌细胞 The effects of Liraglutide on differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into insulin-producing cells Abstract Objective To investigate whether human bone marrow mesenchymal stem cells(hBM-MSCs) could be differentiated into insulin-producing cells(IPCs) by liraglutide, and to find out the optimal concentration and time of this drug. Methods In vitro, P5 cells of HBM-MSCs were induced into IPCs by three-phase induction procedure. The details was that, hBM-MSCs were cultured in HG-DMEM medium containing 25mmol/L glucose for 10 days firstly. And then cells were transferred into LG-DMEM