免疫分子生物学临床寄生虫学检验.ppt

（3）特点 ①极度敏感：以指数方式扩增目的DNA序列 经30个左右循环，扩增倍数可达原来的106。 例如：对疟原虫的检测可达 2μl 血中1个虫体 ②特异性较好：设计特异的引物 避免 DNA 的污染 使用一次性器材 使用最适MgCl2浓度 ③有确诊价值 ④检测条件要求较高，费用较昂贵 （4）适用范围 ①疟疾、弓形虫病和利什曼病等原虫病的诊断 1996年，Khoo用P.f 18S ssRNA基因设计的引物进行巢式PCR可检出低原虫血症10 -6。 巢式PCR可检出1升污水中100个隐孢子虫卵囊。 巢式PCR检测弓形虫P30基因，敏感性可达0.05pg。 Siridewa报道建立了班氏丝虫PCR检测技术。从病人血液和鞘膜积物中提取微丝蚴DNA 模板，检出0.1-1 ml 中1条微丝蚴。 * ②丝虫病、恙虫病和棘球蚴病的诊断 * （二）DNA探针 DNA 探针是指用同位素、生物素或酶以及其它一 些半抗原标记的特定DNA 片段，在与样品DNA 杂交过程中， 借助标记物将这些特异性或差异性DNA 序列探查出来。这一技术主要包括Southern、Nor thern 和斑点杂交、原位杂交等。 1984年， Faranzen首次从恶性疟基因组DNA 文库中分离出一个含有21 个碱基对(bp)单元的重复序列,用32P 标记后进行分子杂交, 可检出10 -5原虫血症, 并具高度种特异性。 1986年，Barker 等用斑点杂交法将DNA 诊断技术用于疟原虫现场。 1988年，张兆松等报道恶性疟FVO 株基因组DNA 探针的斑点杂交, 敏感性达到7 ×10 -6原虫血症水平。 * * 附： ELASA间接法操作： 1）以包被液（碳酸钠－碳酸氢钠缓冲液0.05mol／L，pH9.6）稀释抗原(具体稀释倍数按具体虫体要求），每孔0.1（或0.2）ml包被反应板，37℃湿盒温育2～3小时或4℃过夜； 2）弃去包被液，反应板用去离子水或PBS－Tween液（0.005mol／L PBS含0.05％Tween-20）冲洗3次，甩干； 3）用样本稀释液（0.05mol／L PBS含0.05％Tween-20）稀释样本（起始浓度≥100－1），用样本稀释液（每孔0.1（或0.2）ml，温育1小时； * 4）弃去样液，如上冲洗，甩干加稀释结合物，每孔0.1 （或0.2）ml，温育1～2小时； 5）如上冲洗甩干后即刻加入新鲜配制的底物系统，每 孔0.1（或0.2）ml，置暗盒室温15分钟； 6）终止反应：HRP－OPD系统每孔加1mol/L H2SO4； 7）目测或用分光光度计在490nm波段测定吸收值来判 断。 * 间接血凝实验操作： （1）红细胞鞣化和致敏　 ① 取醛化红细胞用0.15mol／L，pH7.2 PBS离心洗涤2次， 并用PBS配成2.5％悬液； ② 加等量1:2000鞣酸溶液（鞣酸不同批号，质量相差较大必 须预试测定适宜浓度）37℃孵育20分钟，经常摇动； ③ 离心去上清，PBS洗1次，再用0.15mol／L，pH6.4 PBS 配成10％悬液； ④每份悬液加等量适当稀释的抗原液，置于37℃水浴箱中30 分钟（每5分钟振动一次），离心去上清，pH7.2PBS洗2 次，再用含1％正常兔血清（NRS）10％蔗糖缓冲液配成5 ％细胞悬液。加1‰叠氮钠防腐，存4℃或减压冻干备用， 每批致敏细胞均需用已知阳性和阴性血清滴定灵敏度或特 异性。阳性滴度在1:640以上，阴性血清不出现反应者可 用。 * （ 2）微量血凝试验　在U型（或V型）微量血凝板上，将被试血清用1％NRS或BSA生理盐水作倍比系列稀释，每孔含稀释血清0.05ml。每孔加0.01ml致敏红细胞悬液，充分振荡摇匀，加盖于室温静置1～2小时读取结果。 * 谢谢！ * (1) 酶联免疫吸附试验 （enzyme-linked immunosorbent assay．ELISA） 应用最为广泛，目前，国内外已开发出多种寄生虫病快速ELISA诊断试剂盒用于临床。包括有日本血吸虫病、弓形虫病、肝吸虫病、卫氏并殖吸虫病、猪囊虫病、阿米巴病、旋毛虫病、利什曼原虫病、裂头蚴病和棘球蚴病等，ELISA可用作辅助诊断病人、血清流行病学调查和监测疫情的方法。 * 双抗体夹心法：用于检测抗原 包被