课件：第三章-细胞生物学研究方法.ppt

? 细胞的培养 ? 细胞工程 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞的培养 ? 动物细胞培养 ? 类型： 原代培养细胞（primary culture cell） 继代培养细胞（sub-culture cell） ? 细胞株（cell strain）: 正常二倍体，接触抑制 ? 细胞系（cell line）： 亚二倍体，接触抑制丧失 首先从健康动物取出组织块，剪碎，用浓度与活性适中的胰酶或胶原酶与EDTA（螯合剂）等将细胞连接处消化分散，给予良好的营养液与无菌的培养环境（接近体温与体内pH）, 在培养瓶中进行静止或慢速转动培养。不论用何种培养液，一般都要加一定量的小牛血清，这样才有利于细胞的贴壁生长与分裂。 动物原代细胞培养步骤 原代细胞（primary cell） 传代细胞（sub-culture cell） 将肌体取出的细胞或组织进行实效培养。实效培养的细胞大约增殖10代左右，这样的细胞称为原代细胞。 原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。用于传代培养的称为传代细胞。 原代细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可能渡过“危机”而传下去。这些存活的细胞一般又可顺利地传代40-50次，并且仍保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为，这种传代细胞称为细胞株。 细胞株（cell strain）： 由能进行无限次传代培养的细胞群称为细胞系。细胞系细胞与体内原来的细胞比，其形态、结构、遗传上存在不同程度的变异。 细胞系（cell line）： 一般情况下，当细胞株传至50代以后又要出现“危机”，不能传下去。但如有部分细胞发生了遗传突变，并带有癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传下去，这种传代细胞称为细胞系，细胞系细胞的特点是染色体明显改变，一般呈亚二倍体或非整倍体，接触抑制丧失，容易传代培养。如Hela细胞系、BHK21细胞系、CHO细胞系等。 Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养 1、贴附型细胞 （1）成纤维细胞型细胞 细胞长梭形,核圆位中央,胞质常外伸2-3个长短突起,多数细胞排列疏散,有较大细胞间隙,有时也相互平行排列，成群细胞呈放射状、旋涡状等形式。 （2）上皮型细胞 类似上皮细胞而故名。细胞扁平状，排列较规则，贴壁后呈三角形及不规则扁平多角形，中央有偏圆形核，生长时彼此紧密连接成单层细胞，相互拥挤呈现“铺路石块状”，局部可形成单层上皮“膜片组织”。 （3）游走型细胞 在支持物分散生长，一般不连接成片形成群落；细胞质常伸出伪足和突起；在培养皿壁上生长位置不固定，呈活跃的游走和变形运动，速度快且方向不规则；细胞内易出现色暗吞噬颗粒；细胞外形不规则且多变，细胞密度增大连接成片时，形状类似成纤维细胞型或上皮细胞型。 （4）多形型细胞 常见形式：神经细胞和神经胶质细胞。 细胞多形不规则。其不规则形态不象成纤维细胞那样由胞质突起所致，而是一般分胞体和胞突两部分，胞突细长，胞体多形不规则。 2、非贴附型细胞 细胞体外生长时不贴壁，在悬浮培养液中生长而故名，又称悬浮型细胞。细胞呈球形。 常见形式：血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交细胞、转化细胞系等。 培养时，细胞密度大，培养效率高，操作方便，易于大规模生产。 （1）单倍体细胞培养： 用花药在人工培养基上进行培养。可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；也可通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。 （2）原生质体培养 （二倍体体细胞培养）： 先用纤维素酶去掉细胞壁得到原生质体，后者在无菌条件下生长分裂，经诱导分化最终长成植株。也可通过不同植物的原生质体进行融合的体细胞杂交长成体细胞杂交植株。 植物细胞培养 细胞工程使用的主要技术：细胞培养、细胞分化的定向诱导、细胞融合和显微注射等。 二、细胞工程 两个或多个细胞融合成一个双核或多核细胞的现象称细胞融合。融合细胞（杂交细胞）在培养过程中会发生染色体丢失，凡亲本细胞亲缘关系比较近的，连续培养中染色体丢失慢，人、鼠杂交细胞中，人的染色体丢失很快。 动物细胞融合一般用：灭活病毒（如仙台病毒）化学物质（如聚乙二醇，PEG）介导； 植物细胞融合时，先要用纤维素酶去掉纤维素壁。 电融合技术：悬浮细胞在低压交流电场（100-200V/cm）中聚集成串珠状细胞群或将相互接触的单层培养细胞，加高压脉冲促