利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子RNAi表达载体.docxVIP

利用Gateway克隆技术构建丹参SmNACl转录因子RNAi表达载体 ［摘要］NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和 非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC 转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC 转录因子的功能。根据Gateway技术要求，设计含有attB 接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR 方法，扩增SmNAC 1基因的特异性片段。通过BP重组反应， 将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体 pENTR/SD/D-TOPO ±,再通过LR重组反应，利用入门载体上 的SmNACi特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D 上。实验结果表明Gateway载体的构建方法能够高效、快速 地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基 础。 ［关键词］RNAi； Gateway载体；BP和LR反应 Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于入 噬菌体的位点特异性重组原理［1-2］,可以使DNA片段在不 同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不 发生改变。入噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的 整合因子(INF, Int)的作用下，入噬菌体的attP位点和 大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，入噬菌体 DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点: attL, attRo这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis 和细菌的整合因子IHF, Int的共同介导下这两个新位点可 以再次重组回复为attB, attP位点。这一过程受编码蛋白 Xis和整合因子（IHF, Int）调控。 与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖 限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶， 高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector,目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到 目的，是高通量克隆基因的好方法。Gateway技术可以在任 何选择的系统：细菌、酵母、昆虫或哺乳动物等［3-7］进行 基因的功能表达分析。现在的多点Gateway技术［8］,能够 将一个或多个基因克隆到蛋白表达载体，这项强大的体外重 组技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，且同时克隆 效率高达95%或更高。当基因在重组目的表达载体之间快速 简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框，同时， Gateway也有助于进行带有不同标签蛋白的表达和纯化，见 图lo NAC是高等植物中特有的一类转录因子，自20世纪90 年代从矮牵牛分离第1个NAC基因后［9］。拟南芥中已发现 109个NAC转录因子，水稻中有75个NAC［10］o NAC蛋白根 据N端保守序将NAC蛋白分为两大类（I , II）,各包含14 和4个亚类[ll]o NAC转录因子参与植物生长发育的调控， 如花器官的发育、侧根的形成、木质部次生壁的形成以及叶 片衰老等，同时NAC还参与生物胁迫和非生物胁迫。 本项工作设计带有attB位点(CACC)的引物，利用PCR 扩增目的基因SmNAC 1片断，以pENTR/SD/D-TOPO为入门载 体，进行BP重组反应，形成带有目的基因片断的入门载体, 经PCR检测，测序鉴定正确后，在LR Clonase酶作用下， 将BP重组反应的克隆产物与表达载体pK7GWIWG2D,进行LR 重组反应，最终得到含目的基因SmNAC 1的RNAi植物表达载 体。通过使用Gateway技术，简单、快捷、准确的构建成功 丹参转录因子SmNAC 1的RNAi表达载体。 1材料 丹 参 Salvia m订tiorrhiza Bunge 植 株；pENTR Directional TOPO Cloning Kits, Gateway LR Clonase II Enzyme Mix, Gateway 载体 pK7GWIWG2D 均购于 Invitrogen 公司；大肠杆菌Escherichia coli DH5 a感受态购自北京 全式金生物技术有限公司；Phusion超保真聚合酶购自NEB 公司；质粒提取试剂盒购自上海生工生物公司；ExTaq酶购 自大连宝生物工程有限公司；卡那霉素、壮观霉素购自 Amresco公司；所用引物均由生工生物工程(上海)有限公 司合成。 2方法 2. ISmNACI基因RNAi片段的PCR扩增 利用DNAman软件 设计NAC基因的特异性RNAi片段，根据Gateway载体构建 的要求，引物5’末端要加上CACC , NACi-F : CACCATTTTCTCGAATTGAATGATT TGGGCCC； NACi-R： CTGATTTGTG TGTGCCTCGGTTACG□使用Phus