哮喘变异型白介素IL13在呼吸道上皮细胞分泌炎性因子中作用的研究.docxVIP

哮喘变异型白介素IL-13在呼吸道上皮细胞分泌炎性因子中 作用的研究 李波(黑龙江省长水河农场医院164007) 【中图分类号】R562.2【文献标识码］A【文章编号】1672-5085 (2011) 46-0218-03 口细胞介素-13(IL-13)是一种多功能的免疫调节因子，主要由活化的T细 胞仃h2)分泌。大量研究证明，IL?13具有多将近性生物功能。大量研究表明，ILJ3 通过STAT6介导的信号转导途径在哮喘的发生中扮演重要角色。它可以促使呼吸 道上皮细胞分泌上皮粘附分子(ICAM)、嗜酸性粒细胞趋化因子、单核细胞趋化因 子(MCP-1)O这些因子是促进气道炎症及高反应的重要的炎性因子。 IL?13基因多态性与哮喘密切相关。以往实验已经证实，IL?13的单核苛 酸多态性,尤其是编码区exon4第2044位碱基由A代替G,导致氨基酸Argl30Gln 的改变，是变态反应性疾病发病的危险因素。这个位点的突变导致IL?13变异， 变异的IL-13是否也能诱发呼吸道上皮细胞分泌上述炎性因子而导致哮喘的发生 呢？ 本研究通过克隆IL-13及IL-13蛋白变异体Argl30Gin,利用不同量的正 常IL-13与IL-13蛋白变异体Argl30Gha分别对上呼吸道上皮细胞进行刺激，测定 上述炎性因子的分泌，从而证实变异IL-13在哮喘呼吸道上皮细胞分泌屮扮演重 要角色，进一步揭示变异的IL-13及其信号转导途径的变异是哮喘发生的重要环 节。 1材料和方法 1.1材料 1.1.1试剂 正常重组IL-13及重组IL-13变异体为本实验室组建：正常呼吸道上皮细 胞由哈尔滨医科大学克山病研究所赠送；RPMI1640培养基为GIBCO产品。培养 瓶、培养板为Orange产品；MCP?1、ICAM-1 EOTACIN购自上海森雄科技公司(进 口分装）。 1.1.2仪器 紫外分光光度计为美国BIO-RAD公司SmartSpec-TM3000；电热恒温培 养箱为上海市跃进医疗器械一厂，HHbull;Bllbull;500型；STAT FAX-2100型酶 标仪，美国AWARENESS公司；低温高速离心机为BECK- MAN公司CS-15R型。 1.2方法 1.2.1呼吸道上皮细胞的培养 从液氮罐中取出冻存管，立即放入37°C水浴中，快速摇动使其在Imin 内完全融化。无菌条件下打开浆存管，将细胞悬液移入离心管，加入4mlRPMI 1640培养液，lOOOrpm离心5min。弃上清液，用RPMI 1640培养液混悬细胞沉 淀，台酚蓝检测复苏细胞存活率后，调整细胞密度为2?3times;104,分装入培 养液一次以后常规换液传代。 1.2.2实验分组 选择生长良好的呼吸道上皮细胞消化传代。细胞贴壁后，换用无血清 DMEM培养液，继续培养，在第2、4、8、16、24、32、48h分布收集细胞培养 上清液200mu;L实验共分7组： 1组：空白组，未做任何处理的呼吸道上皮细胞培养液； 2组：为正常ILJ3重组蛋白组，取不同浓度分别为： 2?1组：用浓度为10pg / ml重组IL?13蛋白处理； 2?2组：用浓度为lOOpg/ ml重组IL?13蛋白处理； 2?3组：用浓度为1 ng / ml重组IL?13蛋白处理； 3组：为变异IL?13重组蛋白组，取不同浓度分别为： 3-1组：用浓度为10pg / ml变异IL-13重组蛋白处理； 3-2组：用浓度为lOOpg / ml变异IL-13重组蛋白处理； 3?3组：用浓度为Ing/ml变异IL?13重组蛋白处理。 1.2.3细胞分泌因子测定 用双抗体夹心ABC-ELISA法对不同组别、不同吋间的细胞培养液中 sICAM、Eotaxin、MCP-1 分别进行测定。 1.2.4统计学分析 利用两两样本均数比较的方差分析方法进行分析。 2结果 2.1对呼吸道上皮细胞分泌eotaxin的影响 我们对7组实验分别取共同培养后2h、4h、8h、16h 24h、32h、48h 的细胞培养液进行测定，结果如图1, 3?2组与组eomxin分泌水平明显高于 其他组；组16小时以后分泌水平亦高于其他组，说明变异IL-13(Argl30Gln) 刺激呼吸道上皮细胞分泌eotaxin水平明显高于其他组。8?24h分泌量较多。 2.2对呼吸道上皮细胞分泌slCAM-1的影响 利用7组不同浓度和组分的刺激物与呼吸道上皮细胞共同培养后，分别 取2h、4h、8h、16h 24h、32h、48h的细胞组培养液进行测定，结果如图2, 24?32h为分泌高峰。从图中可以看出，利用变异的II43刺激呼吸道上皮细胞 分泌slCAM-1的量远远超过其他组。 2.3对呼吸道上皮细胞分泌MCP?1的影响 利用10组不同浓度和组分的刺激物与呼吸道上皮细