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实验二 过氧化氢的测定 实验二：植物组织过氧化氢含量的测定 一、 实验目的 掌握植物组织屮过氧化氢含量的定量测定原理 了解H2O2对植物大分子物质的损害机理 二、 实验原理 植物组织内积累的H2O2是由一些氧化酶（主要是超氧化物歧化酶 SOD） 催化超阳阴离子发生氧化反应而形成。H2O2相对超阳阴离子性质较 稳定，但 还是一种催化剂，它的存在可以直接或间接地导致细胞膜脂过氧化损 害，加 速细胞衰老和解体。同吋也冇积极地一面，如参与植物抗病性和抗逆 性的启 动和诱导性过程。因此，了解植物组织中H2O2的代谢具有重要意义。 H2O2与硫酸钛（或四氯化钛）反应生成过氧化物一一钛复合物黄色 沉淀， 溶解于硫酸后，在波长410nm出有最大吸收峰，可以进行比色测定。 在一定 范围内，其颜色深浅与H2O2浓度成线性关系 三、 实验材料、设备和试剂 实验材料：雀麦叶片（经过冰冻的和未经冰冻的） 实验设备：研钵、离心管、离心机、试管、容量瓶、分光光度计等 等 实验试剂：①4。条件下处理的丙酮②5umol/ml H2O2③浓氨 水 ④ 5% TiS04 ⑤ 2mol/L H2SO4 四、 操作步骤 1?制作标准曲线 取7支试管，编号1?7,在通风橱中向各试管加入表1所列试剂，混匀， 充分反应后会有沉淀形成，5000r/min,离心5min。留沉淀，弃上清液，并 向各试管沉淀中加入2mol/LH2SO4 5ml,摇动，使沉淀完全溶解。以1号 试管对照调零， 波长410nm处比色测定洛液的吸光度。以吸光度值为纵坐标，过氧化 氢物质的量为横坐标，制作标准曲线（图一）。 表1 H2O2浓度标准曲线试剂加入量 称取样品3g,加入3ml预冷的丙酮，在通风橱中冰浴条件下（由于气 温低，可以不必使用冰浴）研磨成匀浆后，静置片刻，加丙酮定容至5ml, 5000r/min,离心5min。留上清液，并取上清液lml,加入5%TiSO4 0.1ml, 浓氨水0.2ml,出现沉淀后加入2mol/LH2SO4 5ml使之充分溶解，然后进 行比色测定。五、结果处理 根据溶液吸光度，在标准曲线上查出相应的过氧化氢的物质的量，表 示单位为鲜重，计算公式： 过氧化氢含量(umol/g鲜重)=n?v vs?m 其中n为标准曲线查得的溶液过氧化氢物质的量(umol), v为样品提 取液总体积(ml), vs为吸取样品液总体积，m为样品鲜重(g) 由标准曲线查得的数据和实验所用数据分别为： 冰冻的雀麦叶片 A1 =1.475, n=11.956umol, v=5ml, vs=lml, m=3g 则:过氧化氢含量=11.956?5 (umol/g) =19.926 (umol/g) 1?3 未经冰冻的雀麦叶片 A2=0.921, n=7.422umob v=5ml, vs=lml, m=3g 则：过氧化氢含量=7.422?5 (umol/g) =12.370 (umol/g) 1?3 结果表明：在寒冷条件胁迫下，雀麦叶片屮过氧化氢的含量增加。说 明由于体内活性氧代谢加强而使过氧化氢发牛积累，过氧化氢参与了植物 抗逆性过程。 六、注意事项 丙酮在使用前必须要经过预冷处理，并且在4。的条件下使用。因 为， 在冰浴条件下丙酮保持4。可以减少丙酮挥发，减少其对人体的毒害, 而且可以降低过氧化氢的分解过程。 在先后加入5% TiS04和浓氨水时，要进行摇动，摇动次数和时间 应该保 持一致，以减少实验误差。 根据比色皿的体积，加入硫酸的量要不小于5ml0 标准曲线测定结果 图一