基因工程概论课件.ppt

DNA连接酶的作用机理 （1）粘性末端连接 DNA片段连接方式 （2）平末端连接 三 DNA聚合酶 DNA聚合酶活性：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。 基因工程 第一讲 主要内容 1、什么是基因 2、什么是基因工程 1. 什么是基因 詹姆斯·沃森 弗朗西斯·克里克 控制生物性状发育的一段DNA或RNA序列，可通过自我复制遗传给后代。 1.DNA是一条反向平行的互补双链结构,脱氧核糖基和磷酸骨架位于双链外侧；碱基以氢键互补配对(AT,GC)位于内侧；碱基平面与长轴垂直；两条链反向平行，一条链走向5’→3’?，另一条链3’→5’。 ? 2.DNA是右手螺旋线性分子，右手螺旋。直径2nm，螺距3.4nm，一周包含10个碱基对：每个硷基平面的旋转角度36度。外观上一个大沟一个小沟。 ? ?DNA复制过程中首先两条链间的氢键破裂并且双链解旋和分开，然后以每条链为模板，按碱基互补配对原则，由DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸底物合成新的DNA互补链，这样新形成的两个DNA分子与原来的DNA分子的碱基序列完全相同。在此过程中，每个子代DNA的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的。因此称这种复制方式为半保留复制。 半保留复制 基因通过蛋白质参与生理生化过程发挥功能。基因是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。 基因在结构上是可分的。 基因表达调控：基因在功能上是可分的。 总结： 所有生物的DNA的基本结构都是一致； 遗传密码是通用的； 基因在DNA顺序上的多样性； 基因可人工分离和合成。 2. 什么是基因工程 基因工程是在分子水平上进行的遗传操作，将某种生物体的基因（目的基因）或者人工合成的基因或DNA片段与合适的载体连接后，转移到另外一种生物的细胞内，使之能在受体细胞遗传并表达，使受体生物获得新的遗传性状的技术操作。 少数RNA病毒外，几乎所有的基因都存在于DNA结构中，而用于外源基因拼接的载体也都是DNA分子，因此基因工程也称为重组DNA技术。 ? DNA重组分子大都在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆或基因的无性繁殖。 可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。 某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能。 生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。 基因工程的目的 基因工程的特征 基因工程的技术策略 强化基因表达，改善生物性状 关闭特定基因的表达，改善生物性状 基因的异源表达，赋予生物新的功能 限制性核酸内切酶——基因的剪刀 ? DNA连接酶——基因的针线 ? 基因工程载体的发现  基因工程诞生的技术基础 基因工程的操作，是在分子水平上的作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶， 连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因 进行人工切割，拼接和扩增等操作。所 以把这些酶称之为“工具酶”。 常用的工具酶： 限制性核酸内切酶 切割DNA DNA连接酶 生成3′- 5′磷酸二酯键 DNA聚合酶Ⅰ 探针标记、补平3′末端 反转录酶 cDNA合成 多聚核苷酸激酶 5′磷酸化、探针标记 末端转移酶 3′末端多聚尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 第二讲 主要内容 1、基本概念 2、3种常用的酶 限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核糖核酸酶：专门水解断裂RNA分子, 脱氧核糖核酸酶：特异水解断裂DNA分子 。 核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残基之间 的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸 链发生水解断裂的蛋白酶。 基本概念 核酸外切酶:从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一 个核苷酸地消化降解多核苷酸链。 核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之 断裂形成小片段 基本概念 一 限制性内切酶 Restriction Enzyme (RE) 一种能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷 酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链 的核酸内切酶。 ?1970年，Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind?III，使DNA分子的切割成为可能。 ?1972年在旧金山H.W.Boyer实验室又发现了名叫EcoR?I的核酸内切酶（大肠杆菌中发现），这种酶每遇到GAATTC序列，就会将双链DNA分子切开形成DNA片段。 限制性内切酶的发现 限制性内切酶的切割方式 粘性末端：具有互补碱基的单链突出末端，能 够通过互补碱基间的配对重新连接。 平头末端：即碱基配对完好的末端。 限