乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验.doc

乳与乳制品病原微生物检验方法单增李斯特菌的检验 YLNB 4.6 1. 仪器及器材 1.1 恒温培养箱：30±1℃、24±1℃ 1.2 恒温水浴锅：46±1℃。1.3 显微镜：10×～100×1.4 离心机：4000 r/min1.5 均质器或灭菌乳钵。1.6 灭菌平皿：直径90mm。1.7 灭菌试管： 16mm×160mm1.8 灭菌吸管：1mL（具有0.01mL刻度）、10mL（具有0.1mL刻度）。 1.9 冰箱：0－4℃ 1.10 锥形瓶：100mL、500mL。 1.11 架盘药物天平：0g～500g,精确至0.5g。 1.12 离心管：30mm×300mm。 1.13 灭菌注射器：11.14 单核细胞增生李斯特氏菌标准株。1.15 马红球菌。1.16 小白鼠：16g～18g。 2. 培养基和试剂 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉汤(TSB－YE)：见附录A1。 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆琼脂(TSA－YE)：见附录A2。 EB增菌液：见附录A3。 2.4 LB增菌液(LB1，LB2)：见附录A4。2.5 三糖铁(TSI)琼脂：GB/T4789.28中4.26，4.27。2.6 SIM动力培养基：见附录A5。2.7 血琼脂：GB/T4789.28中4.6。2.8 改良的Mc Bride(MMA)琼脂：见附录A5。2.9 硝酸盐培养基：GB/T 4789.28中3.17。2.10 缓冲葡萄糖蛋白胨水(MR和VP试验用)：GB/T4789.28中3.4。2.11 糖发酵培养基：GB/T4789.28中3.2。2.12 过氧化氢酶试验：GB/T4789.28中4.38。2.13 盐酸吖啶黄(AcriflavineHCl)(Sigma)。2.14 萘啶酮酸钠盐(Naladixicacid)(Sigma)。3. 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌检验程序如下：　　 检样25g(ml) 检样25g(ml) LB1增菌液225mlEB增菌液225ml LB1增菌液225ml EB增菌液225ml 30℃,48h 30℃,24h LB2增菌液225ml LB2增菌液225ml 30℃,24h 选择性培养基(MMA) 选择性培养基(MMA) 30℃,24～48h TSI琼脂SIM动力培养基 TSI琼脂 SIM动力培养基 25℃ 2d～5d(伞状) 30℃,24h TSA-YE培养基 TSA-YE培养基 30℃,24h 溶血实验MR-VP实验小鼠致病力实验协同溶血实验革兰氏染色显微镜下观察运动硝酸盐还原实验过氧化氢酶实验甘露醇七叶苷鼠李糖木醇 溶血实验 MR-VP实验 小鼠致病力实验 协同溶血实验 革兰氏染色 显微镜下观察运动 硝酸盐还原实验 过氧化氢酶实验 甘露醇 七叶苷 鼠李糖 木醇 4. 方法4.1 样品的收集及处理　　无菌取样品25g(mL)放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。4.2 增菌培养　　EB增菌液放30±1℃培养48h，LB1增菌液225mL放30±1℃，培养24h，吸取0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。4.3 分离培养　　将EB增菌液和LB2二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30±1℃ 48h，挑选可疑菌落，用白炽灯45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形的菌落。4.4 选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁(TSI)琼脂和SIM动力培养基，培养于25±1℃，观察是否有动力，且成伞状或月芽状生长。一般观察2～7d，阳性者可做下一步鉴定。4.5 纯培养　　将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培基上层、下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA－YE)上，做纯培养供做以下鉴定。4.6 染色镜检　　将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。4.7 生化特性　　将上述可疑菌做进一步的生化试验，单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有关菌的区别见表1。　　 表1单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别 菌种 溶血反应 硝酸盐还原 尿素酶 MR-VP 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷 单核细胞增生李斯特氏菌 + - - +/+ -