小单孢菌产生的抗真菌抗生素.docxVIP

第一部分小单孢菌的分离、培养及抗真菌活性代谢产物的筛选 材料和方法 1、样品采集 小单孢菌属水生微生物，在江河、湖泊、沼泽等富水环境及其周围分布较多，为 分离得到新菌源，尽量采集生态保持较好、未受破坏的特殊环境下的样品，如森林中 的水流边较潮湿且肥沃的土壤、植物残体丰富的枯枝落叶层的土壤、湖底士、池塘土、 沼泽土，特别是海洋土样以及海洋动植物样品等，从中分离小单胞菌。 采样：预先准备好无菌铝盒或纸袋，贴好标签，记录采样时间、地点、植被(或 生态小生境)，土壤类型等基本数据。采集后的样品尽可能快地进行分离。 2、样品预处理 土样预处理方法： 1)称取土样39。 2)将39土样加入到装有30ml高压灭菌过的0．9％NaCl溶液(含有玻璃珠)的250m1 三角瓶。 3)置32℃旋转式摇床振荡lO分钟。 4)取出三角瓶土壤悬液，用无菌生理盐水稀释，使其终浓度为lO～、10一、 lO一、10“，待分离。 3、样品分离 i)小单孢菌分离 (1)分别吸取已稀释好的样品悬液(10一、10～、10“)各lml，加入到无菌的 培养皿中(巾90嘞)，并在培养皿上注明样品样号及稀释度。 (2)将己熔化并冷却至5012左右的分离培养基(已加入选择性抑制剂)约20ml 倒入培养皿中，边倒边摇，使样品悬液与培养基混合均匀，冷却凝固。 分离培养基： A．高氏-天冬素琼脂 可溶性淀粉 2％ L天冬素 0．05％ KN03 O．1％ K2HP04·3H20 O．05％ NaCl O．05％ MgS04·7H20 O．05％ CaC03 O．1％ 琼脂 1．5％ 蒸馏水配制 pH 7．5(消前) B．甘油-天冬素琼脂 L天冬素 O．1％ 甘油 l％ K2HP04·3H20 O．1％ 微量盐溶液· 0．1mYl00ml 琼脂 1．5％ 蒸馏水配制 pn 7．5(消前) ·微量盐溶液： FeS04·7H20 0．19 MnCl2．4H20 0．19 ZnS04·7H20 0．19 蒸馏水 looml C．CV培养基 煤粉(过200目筛) 1．59 VBl 0．5mg VB2 0．5mg VB6 0．5mg 肌醇 0．5mg 6 泛酸钙0．5rag 烟酸0．5rag 对氨基苯钾酸0．5mg 生物素0．25mg 琼脂 159 蒸馏水 1000ml pH 7．5(消前) D．高氏-天冬素一维生素琼脂 高氏一天冬素+cV培养基中的维生素(含量相同) E．淀粉-酵母膏琼脂 淀粉 2％ 酵母膏0．2％ CaCOs 0．3％ 琼脂 1．5％ 蒸馏水配制 pH 7．5(消前) 选择性抑制剂： A．重铬酸钾，终浓度50ppm。 B．多菌灵(含50％苯丙眯唑)，终浓度1000u g／ml。 C．庆大霉素，终浓度3ttg／nll。 培养 分离的琼脂平板倒置于35(3培养7-10天。 0i)挑种 将已培养好的分离琼脂平板挑取具有小单孢菌培养特征的菌落并转接到与分离培养基相对应的琼脂斜面培养基上，35C培养15天。 (iti)菌种纯化 挑出的菌种培养中如发现有染菌，在相应的琼脂平板上划线分离进行单菌落的纯 化。 4、小单孢菌产生的活性物质筛选 (i)发酵 为尽可能保证筛选菌株的生长以及发酵过程活性代谢产物的合成，采用两种种子 培养基和3种发酵培养基进行培养发酵。一铂环的斜面培养物接入液体种子培养基A 或B，32C振荡培养36～80小时，选择一种生长较好的一级种子转接到二级发酵培 养基中，并以10％接种量分别转入三种发酵培养基(250ml三角瓶，装量30m1)，320， 220rpm振荡培养96～120小时。 种子培养基A： 可溶性淀粉 15．og 葡萄糖 5．og 蛋白胨(肉胨) 5．og 酵母粉 5．09 (NI-hhS04 0．59 K2HP04·3H20 0．59 NaCl 0．59 MgS04·7H20 0．59 CaC03 1．og 自来水 1000ml pH 7．5(消前)1210灭菌30分钟 种子培养基B： 葡萄糖 m 牛肉膏 。 多胨 2 酵母膏 ， CaC03 。 自来水 舳略昭芑}眙昭m pn 7．2(消前)121℃灭菌30分钟 1号发酵培养基： 可溶性淀粉 40．Og 葡萄糖 5．og 黄豆饼粉 25．09 酵母粉 5．og MgS04·7H20 0．59 K2HP04·3H20 0．59 CaC03 1．09 自来水 1000ml pn 7．5(消前)121℃灭菌30分钟 2号发酵培养基： 可溶性淀粉 40．og 葡萄糖 5．og 花生饼粉 20．og 蛋白胨(肉胨) 5．09 MgS04·7H20 0．59 K2HP04·3H20 0．59 CaC03 1．og 自来水 1000ml pH 7．5(消前)121。C灭菌30分钟 3号发酵培养基： 可溶性淀粉 45．o