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实验5 水稻幼苗体内硝酸还原酶的诱导 P33-35 实验目的 硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）是诱导酶，是植物氮素代谢作用中的关键性酶，它与作物吸收和利用氮肥有关。 实验原理 （1）NR作用于NO3-，使其还原为NO2- （2）NO2ˉ含量的测定 氨基苯磺酸（sulfanil-amide，磺氨）比色法。在酸性溶液中磺氨与NO2ˉ形成重氮化合物，该重氮化合物再进一步与α-萘胺偶联形成紫红色的偶氮化合物。 反应受酸度和温度影响，酸度大则提高重氮化作用的速率，但降低偶联作用的速率，升高温度，可以提高反应速率，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。反应生成物颜色比较稳定，方法灵敏，可达0.5μg·mL，pH7.5时，540nm有最大吸收 ◆ 实验器材： 分光光度计，冷冻离心机，研钵，移液管，进样器，石英砂，电子天平等。 ◆ 实验试剂： NaNO2标准溶液 提取液缓冲液：25mM磷酸缓冲液（PBS，pH8.7），含1mM EDTA、10mM半胱氨酸； 反应缓冲液：0.1M磷酸缓冲液（PBS，pH7.5）； 0.1M KNO3溶液（pH7.5 PBS配置） 2mg/mL NADH溶液（pH7.5PBS配置） 1%磺胺溶液（浓盐酸配置，盐酸终浓度3M） 0.02% α-萘胺（萘基乙烯胺）溶液（dH2O配置） ◆ 实验材料：水稻叶片 ◆ 标准曲线制作 ◆ 样品中NR活力的测定 1.取样宜在晴天进行，最好提前一天使用一定量的硝态氮，取样部位尽可能一致。 2.硝酸还原酶容易失活，离体法测定时，操作应迅速，并且在4℃下进行。 3.硝酸盐还原过程应在黑暗中进行，以防亚硝酸盐还原为氨。 4.从显色到比色时间要一致，显色时间过长或过短对颜色都有影响。 5.NADH易被氧化，需现用现配。 结果计算： 单位鲜重样品酶活性（μg NO2ˉ·gFW-1·h-1）： 2.分析影响试验结果的因素。 3.若取样前植物分别处于光照或黑暗条件下，则酶活性有何不同？为什么？ * 离体法 活体法 繁杂、要求条件较高，重复性好 简单，结果偏低、重复性不够理想 目的：熟悉应用离体法测定NR的活力 离体法 NO3ˉ+NAD(P)H+H+ NO2ˉ+NAD(P)++H2O 活体法 NO3- 组织细胞 NO2ˉ 渗透到外界溶液 测定溶液中NO2-含量 NR活性 NR 提取NR 反应体系 NO3- NO2ˉ 测定NO2-含量 NR NR活性 实验原理 ???????????????????????  ? 重氮化合物 ?α-萘胺? 对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺 对氨基苯磺酸 （磺氨） 实验原理 ???????????????????????  ? 重氮化合物 ?α-萘胺? 对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺 对氨基苯磺酸 （磺氨） 保证反应需要的pH环境 器材与试剂 实验步骤 540nm比色（对照管做空白调零） 取样0.5g 少量预冷提取缓冲液（pH8.7） 提取缓冲液定容至10mL 4℃，4000rpm离心15min 分别取0.4mL上清液加入2支试管中 分别加1.2mL KNO3磷酸缓冲液（pH7.5） 反应管加0.4mL NADH溶液 对照管加0.4mL pH7.5PBS 25℃暗反应30min 加1mL磺胺 加1mL萘胺 显色15min 4000rpm5min 研磨 取两支试管 对照管： 0.4mL上清液 1.2mL KNO3 PBS 0.4mL pH7.5PBS 反应管： 0.4mL上清液 1.2mL KNO3 PBS 0.4mL NADH 注意事项 实验报告（作业） wt χ v2 v1 × 实验材料为蒸馏水处理（或50mM硝酸钾诱导一天）， W=？g，A=？ χ =? μg 酶活力：？ 比较同组另一结果，给出酶是否为诱导酶的结论 χ：反应液中NO2ˉ 的总量（μg） V1：酶液的定容体积（10mL） V2：反应液中加入的粗酶液体积（0.4mL） W： 样品鲜重（g） t: 反应时间（h） χ按标曲回归方程计算： χ=22A+0.1533 实验报告（作业） *