细胞内细胞因子的流式检测讲解.pptVIP

细胞内细胞因子的流式检测 基本概念 细胞内细胞因子染色是用抗细胞因子 抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志组合， 即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌。 Th1 细胞分泌 IFN-g 、 IL-2 、 TNF-a Th2 细胞分泌 IL-4;IL-5;IL-10 技术优势 ? 快速 ：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需 6- 8 小时，实际操作时间为 1-2 小时，快速简便 ? 简便 ：无需组织培养，可以全血分析，无需分离 PBMC ? 灵敏度高 ：高度灵敏的荧光标记与检测系统 ? 高效 ：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根 据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分 析 ? 安全 ：减少样本处理与生物源性污染 ? 接近生物体的分析条件 ：全血检测保留细胞及生化微环境更准确反映 了体内状况 所需试剂 1 、细胞表面染色用的荧光标记的单抗试剂 如 CD3 、 CD4 、 CD8 、 CD25 等 2 、荧光标记的细胞因子抗体： 如 IFN-g 、 TNF-a 、 IL-2 、 IL-4 等 3 、溶血素： 裂解红细胞 4 、激活剂： 如 PMA 、 Ionomycin ，可以刺激 T 细胞活化并分泌细胞因子 所需试剂 5 、阻断剂 阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚 集在胞浆内质网内，以利于准确检测细胞产生细胞因子的能力。 Monensin Brefeldin-A(BFA) 6 、固定剂 固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在 细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。 一般使用含 4% 的多聚甲醛 PBS 溶液 7 、破膜剂 将细胞膜穿孔，以利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，与 相应的细胞因子结合。 一般使用含 1 ％皂甙、 0.05 ％ NaN2 的 Hanks 溶液 /HBBS 操作步骤 ? 细胞表面抗原染色 ? 刺激细胞 （ PMA 、 Ionomycin 、 BFA ） ? 固定、破膜 ? 细胞因子染色 注意事项 ? 标本处理 ： 避免使用络合钙的抗凝剂，如 ACD 与 EDTA ，因为它们会 限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。血样在 8 小时内分析，超过 8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少 5% 。如不能在 8 小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 ? 刺激激活 ： 检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和 刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测 IFN- γ 则可选择 PMA 和 Ionomycin 同时刺激；如果用 CD4 做表面标记，由于多数病人的 CD4 抗原会因 PMA 的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长， 4-6 小时为宜，否则 CD4 下调影响分析。 注意事项 ? 选择合适的对照 ： 为保证结合的真是和可靠性，至少应该设置以下对照： ①未刺激对照 ： 激活时由于 BFA 的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过 程中产生的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含 BFA 。 ②激活对照 ： 激活对照使用细胞表面表达 CD69 来评价激活与否，如果未达到 CD69 期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不 当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。 ③同型对照 ： 使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的 免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。 注意事项 ? 使用适当细胞表面阻断试剂 ， 减少非特异性的背景染色，保证结 果的准确性 ① Fc 受体阻断 ： 使用试剂阻断 Fc 受体可以有效减少非特异荧光染色，在 小鼠可以用纯化的抗小鼠的 CD16/32 ，在人可以用过量的同种无关纯化 Ig 或血清。 ② 表面结合的细胞因子的阻断 ： 使用相同克隆的纯化的细胞因子抗体， 阻断细胞表面结合的细胞因子，阻断由于荧光抗体与表面细胞因子结合 引起的背景。 ? 荧光素的选择： 检测相对低表达细胞因子如 IL-4 时，应选用 PE 或 APC 标记；单检测某一细胞因子时最好也选用 PE 或 APC 标记