11.3生物制品分析方法-电泳法和酶法.pdf

生物制品分析的常用方法 生物制品分析中常用的方法包括理化分析法、电泳法、酶法、免疫法、生物检定法等。 理化分析法在前面章节已有介绍，本节主要介绍电泳法、酶法和免疫法。 一、电泳法 所谓电泳就是带电粒子或离子在电场作用下的定向移动，依据带电粒子在电场的作用下 迁移行为的不同进行分离的技术称为电泳（electrophoresis ）。尽管电泳方法种类繁多，但基 本原理是一致的，归纳起来，可分为三类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。其中最常 见的为区带电泳，它是样品在惰性支持物上进行电泳，被分离成不同区带，从而达到分离分 析的目的。 1、琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为介质，依靠蛋白质的带电性质等进行分离。该方法在DNA 等的分离中应用 较多。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE ） 以聚丙烯酰胺为支持介质，依靠蛋白质的带电性质、分子筛作用及凝胶的浓缩作用等进 行分离，其分辨力很好，具有机械强度好，对pH 和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用， 并且制备重复性好，操作中不污染样品等特点。 聚丙烯酰胺凝胶是使用丙稀酰胺（acrylamide ，简称 Acr ）和交联剂亚甲基双丙稀酰胺 （N ，N-methylene bisacrylamide ，简称Bis ）在催化剂的作用下聚合而成。两者的比例决定 胶的机械性能、弹性、透明度等。有时可加入琼脂糖或蔗糖以增加胶的机械强度。 聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中有三种物理效应：样品浓缩效应、凝胶的分子筛效应、一般 电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用纸 电泳仅可分为5~7 个组分，而用PAGE 可分成20～30 个条带清晰的成分。 样品浓缩效应是由于电泳基质的凝胶的不连续性、缓冲液离子成分不连续性、电位梯度 的不连续性、pH 的不连续性这四个不连续性，使样品在电泳时得以浓缩，区带宽度变窄。 蛋白质检测一般采用蛋白质染色和同工酶染色两类方法。蛋白质染色常用氨基黑 10B、 考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸和银染法染色。考马斯亮蓝G250 染色法有重复性好的特点，银染法灵敏度高，两者应用最为广泛。 3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 以聚丙烯酰胺凝胶为介质，同时加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），其分子中具有大量负电荷，与蛋白质结合后可掩盖蛋白质不同的带电性质， 因而电泳迁移率只与蛋白质的分子量相关。它不仅可用于生物制品的纯度检查，也可用来测 定蛋白质的分子量。SDS-FAGE 法的优点是设备简单、操作方便、误差小、重复性好。该法 可用常规染色方法，也可用紫外吸收扫描法进行分子量测定、电泳纯度检查和电泳成分的百 分含量测定。 加入SDS 后，可以破坏蛋白质分子间以及与其他分子间的共价键。蛋白质分子与SDS 形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。此复合物所带的SDS 负电荷大大超过蛋白质分子原有 电荷量，这就消除了不同种类蛋白质间电荷差异。同时蛋白质-SDS 复合物在水溶液中形状 为长椭圆棒形，其短轴长度基本相同，均为 18Å，但长轴长度与蛋白质分子量大小成正比。 因此，这种复合物在 SDS体系中的迁移只取决于蛋白质分子量的大小。当分子量在 1.5 万至20 万之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈对数线性关系。 lg MW=-b ×mR+K 式中，MW 为蛋白质分子量，mR 为相对迁移率，b 为斜率，K 为截距。一定条件时，b 和K 均为常数。 4、等电聚焦电泳法（isoelectric focusing， IEF 或EF ） 等电聚焦电泳法是一种高分辨率的蛋白质分离新技术。它是利用蛋白质分子或其他两性 分子等电点的不同，在一个连续的、稳定的、线性的pH 梯度中进行蛋白质分离。蛋白质在 pH 梯度中根据所带电荷的不同，向不同的电极发生迁移，当到达其等电点位置时，蛋白质 的净电荷为零，不再进一步迁移，在其等电点位置聚焦成一个窄而稳定的带。由于具有分辨 率高、重复性好、操作简便、迅速等优点，该方法应用非常广泛。在等电聚焦中，分离仅仅 决定于蛋白质的等电点。由于蛋白质只能在其等电点位置被聚焦成一条窄而稳定的带，因而 等电聚焦的分辨率、灵敏度大大高于常规电泳。