药品生物检定技术 1.1 基因重组 项目五-1-基因重组 教案.docVIP

药品质量与安全专业教学资源库 《药品生物检技术》教案 知识点 基因重组 学时 0.5学时 教学内容 基因重组的概念；转化；接合；转导；原生质体融合 教学重点 转化、转导 教学难点 转化和转导 接合、原生质体融合 参考资料 药品微生物检验技术 主编：孙祎敏 中国医药科技出版社 微生物检测技术 主编：叶磊 化学工业出版社 药用微生物技术 主编：郝乾坤 重庆大学出版社 基因重组的概念：来自两个不同细胞的基因（DNA）所发生的转移和结合称为基因重组。基因的转移和重组大大增加了生物的遗传多样性。在微生物中，基因的传递可以使病毒将遗传信息传给细菌，使细菌致病性得以提高以及细菌产生抗生素抗性等。另一方面人为的控制微生物的基因转移和重组的研究成果有助于解决农业、工业、医学问题以及预防和治疗传染病的难题。本项目将介绍微生物基因转移和重组的四种现象和机制。 转化 受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换将其整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌部分遗传性状的现象称为转化。通过转化方式而形成的杂种后代，称为转化子。转化因子指有转化活性的外源DNA片段，它是供体菌释放或人工提取的游离DNA片段。 图6.5 转化过程示意图 接合 接合是通过供体菌和受体菌的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。 细菌的接合现象在大肠杆菌中研究的最清楚。大肠杆菌有性别分化，决定它们性别的因子称为F因子。F因子是一种质粒，在大肠杆菌中每个细胞含有约1～4个F因子。F因子既可脱离染色体在细胞内独立存在，也可整合到染色体组上；它既可经过接合作用而获得，也可通过一些理化因素(如吖啶橙、丝裂霉素、利福平、溴化乙锭和加热等)的处理而从细胞中消除。含有F因子的大肠杆菌称为F＋菌株，不含有F因子的大肠杆菌称为F－菌株。 F＋菌株可以与不含F因子的F－菌株接合，从而使后者也成为F＋菌株。其过程大体可分两个阶段：首先是F＋菌株与F－菌株配对，并通过性菌毛接合（见图6.6）；然后F因子双链DNA的一条单链在一特定的位置断开，通过性菌毛内腔向F－菌株细胞内转移，并同时在两个菌株细胞内以一条DNA单链为模板，各自复制合成完整的F因子，见图6.7 图6.6 大肠杆菌接合的透射电镜照片 图6.7 F＋和F－接合示意图 转导 通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。由转导作用而获得部分新遗传性状的重组细胞，称为转导子。 转导现象是由J.Lederberg等 (1952年) 首先在鼠伤寒沙门氏菌中发现的。以后在许多原核微生物中都陆续发现了转导，如大肠杆菌属，芽孢杆菌属，变形杆菌属，假单胞菌属，志贺氏菌属和葡萄球菌属等。转导现象在自然界中比较普通，它在低等生物进化过程中很可能是一种产生新基因组合的重要方式。目前所知道的转导已有多种，现分别介绍如下。 一、普遍转导 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。噬菌体侵入寄主细胞后，通过复制和合成，亦将寄主DNA降解为许多小片段，进入装配阶段。正常情况下，噬菌体将自身的DNA包裹在衣壳中，但也有异常的可能。它误将寄主细胞DNA的某一片段包裹进去。这样的噬菌体称缺陷噬菌体。体内仅含有供体DNA的缺陷噬菌体称完全缺陷噬菌体。体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的缺陷噬菌体称为部分缺陷噬菌体。这种异常情况出现的概率很低（10-5～10-8)。由于噬菌体产生子代数量很多，所以这种异常情况的出现还是很多的。当包裹有寄主DNA片段的噬菌体释放后，再度感染新的寄主，其中的供体菌的DNA片段进入受体菌，并通过基因重组使受体菌形成稳定的转导子。 二、局限转导 局限性转导指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。最初于1954年在大肠杆菌 K12中发现。它只能转导一种或少数几种基因（一般为位于附着点两侧的基因）。 原生质体融合 通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程，称为原生质体融合。由此法获得的重组子，称为融合子。原核生物原生质体融合研究是从20世纪70年代后期才发展起来的一种较有效的遗传物质转移手段。 原生质体融合的主要操作步骤是：先选择两株有特殊价值，并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本菌株置于等渗溶液中，用适当的脱壁酶（如细菌和放线菌可用溶菌酶等处理，真菌可用蜗牛消化酶或其他相应酶处理）去除细胞壁，再将形成的原生质体（包括球状体）进行离心聚集，加入促融合剂PEG(聚乙二醇)或借电脉冲等因素促进融合，然后用等渗溶液稀释，再