微生物代谢综合项目工程答案整理.docVIP

微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。 定义：经过一些特定生化反应修饰来定向改善细胞特征功效，利用重组DNA技术来发明新化合物。 研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流定量分析；代谢网络重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作。 研究手段：代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域最新结果。所以，在研究方法和技术方面关键有下列三大常见手段： (1)检测技术：常规化学和生物化学检测手段全部可用于代谢工程研究，如物料平衡、同位素标识示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。 (2)分析技术：采取化学计量学、分子反应动力学和化学工程学研究方法并结计算机技术，说明细胞代谢网络动态特征和控制机理，如稳态法、扰动法、组正当和代谢网络优化等。 (3) 基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络操作实质上能够归结为基因水平上操作：包含几乎全部分子生物学和分子遗传学试验技术，如基因和基因簇克隆、表示、调控，DNA 杂交检测和序列分析，外源DNA转化，基因体内同源重组和敲除，整合型重组DNA 在细胞内稳定维持等。 2.代谢改造思绪和代谢设计原理。 代谢改造思绪： 依据微生物不一样代谢特征，常采取改变代谢流、扩展代谢路径和构建新代谢路径三种方法。 (1)改变代谢路径方法：加速限速反应，增加限速酶表示量，来提升产物产率。改变分支代谢路径流向，提升代谢分支点某一分支代谢路径酶活力，使其在和其它分支代谢路径竞争中占据优势，从而提升目标代谢产物产量。 (2)扩展代谢路径方法：在宿主菌中克隆和表示特定外源基因，从而延伸代谢路径，以生产新代谢产物和提升产率。扩展代谢路径还可使宿主菌能够利用本身酶或酶系消耗原来不消耗底物。 (3)转移或构建新代谢路径：经过转移代谢路径、构建新代谢路径等方法来实现。 代谢设计原理： 现存代谢路径中改变增加目标产物代谢流：增加限速酶编码基因拷贝数；强化关键基因表示系统；提升目标路径激活因子合成速率；灭活目标路径抑制因子编码基因；阻断和目标路径相竟争代谢路径；改变分支代谢路径流向；构建代谢旁路；改变能量代谢路径； 在现存路径中改变物流性质：利用酶对前体库分子结构宽容性；经过修饰酶分子以拓展底物识别范围； 在现存路径基础上扩展代谢路径：在宿主菌中克隆、表示特定外源基因能够延伸代谢路径，从而生产新代谢产物、提升产率。 3. 微生物基因操作技术有哪些？（举两例说明） 微生物基因操作技术有：核酸凝胶电泳、核酸分子杂交技术、DNA序列分析、基因定点诱变、细菌转化、利用DNA和蛋白质相互作用进行核酸研究、PCR技术等。 基因定点突变(site-directed mutagenesis)：经过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码氨基酸序列，用于研究氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性和结合配体能力影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表示载体、引入新酶切位点等。关键采取两种PCR方法，包含重合延伸技术和大引物诱变法。在硫化细菌核苷水解酶对底物专一性研究中，采取定点突变技术，对编码221位和228位氨基酸DNA序列进行突变，改变两个位点氨基酸，从而研究氨基酸残基对底物结合影响。 基因敲除(gene knock-out)：又称基因打靶，经过外源DNA和染色体DNA之间同源重组，进行正确定点修饰和基因改造，含有专一性强、染色体DNA可和目标片段共同稳定遗传等特点，可分为完全基因敲除和条件型基因敲除。在谷氨酸棒杆菌生产缬氨酸研究中，采取基因敲除方法进行高产菌株构建。如ilvA基因敲除，使苏氨酸脱氨酶合成降低，降低异亮氨酸合成前体，从而降低异亮氨酸合成，增加缬氨酸生成。 4. 什么是酶反馈抑制，以缬氨酸代谢路径来举例说明。 酶反馈抑制：指最终产物抑制作用，即在合成过程中有生物合成路径终点产物对该路径酶活性调整，所引发抑制作用，包含次序反馈抑制、同工酶反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、增效反馈抑制。 以缬氨酸为例：缬氨酸由丙酮酸合成，包含四个反应，分别由四个酶催化，依次为乙酰羟酸合酶(AHAS)、乙酰羟酸同分异构酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)和支链氨基酸转氨酶(TA)。首先，由AHAS将两分子丙酮酸缩合成2-乙酰乳酸；其次，AHAIR将2-乙酰乳酸转化为双羟基异戊酸；再次，由DHAD将双羟基异戊酸脱水形成2-酮异戊酸；最终，TA将2-酮异戊酸转化为L-缬氨酸。L-缬氨酸和L-异亮氨酸合成共享AHAS 、AHAIR、DHAD和TA等4种酶。如AHAS以丙酮酸为底物则合成L-缬氨酸，而用丙酮酸和2-酮丁酸为底物则合成L-异亮氨酸。 缬氨酸合成反馈抑制关键对象是其合成路径上第一个关键酶乙酰羟酸合酶（AHAS），同时缬氨酸和异亮氨酸合成酶系受三个末端产物缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸多价阻遏。所以，假如解除AH