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鸭疫里氏杆菌PhoP/PhoR 双组份系统对基因表达的调控及基因岛整合酶功能研究 目 录 摘要i ABSTRACT iii 缩略词表vi 第一章文献综述 1 1 鸭传染性浆膜炎概述 1 1.1 病原学 1 1.2 流行病学2 1.3 临床症状2 1.4 诊断与防治 3 2 鸭疫里氏杆菌毒力（相关）因子研究进展 3 3 双组份调控系统 5 3.1 PhoP/PhoQ 双组份系统 6 3.2 PhoP/PhoR 双组份系统 7 4 细菌基因岛研究进展 8 5 噬菌体与前噬菌体 10 6 目的和意义 11 第二章RAYM_RS09735/RAYM_RS09740 基因缺失株转录组学分析及其对鸭疫 里氏杆菌基因表达的影响 12 1 目的和意义 12 2 材料 12 2.1 菌株和质粒 12 2.2 主要分子生物学及生化试剂 12 2.3 主要溶液的配制 13 2.3.1 抗生素类 13 2.3.2 培养基 13 2.3.3 其他缓冲液与试剂的配制 13 2.4 细菌的培养 15 2.5 实验动物 15 I 华中农业大学2020 届博士研究生学位（毕业）论文 2.6 主要仪器设备 15 3 实验方法 15 3.1 鸭疫里氏杆菌转录组测序 16 3.1.1 鸭疫里氏杆菌RNA 提取 16 3.1.2 构建转录组文库及测序分析 16 3.2 荧光定量PCR 验证差异表达基因 17 3.2.1 cDNA 的合成 17 3.2.2 实时荧光定量PCR 18 3.3 鸭疫里氏杆菌转录因子phoP 基因的克隆及蛋白的表达与纯化 18 3.3.1 phoP 基因的克隆 18 3.3.2 表达质粒pET28a-phoP 的构建与鉴定 20 3.3.3 PhoP 蛋白的诱导表达 21 3.3.4 SDS 21 3.3.5 PhoP 蛋白的纯化 22 3.4 鸭疫里氏杆菌PhoP box 序列的预测 22 3.5 凝胶迁移实验鉴定PhoP 直接调控基因 22 3.5.1 生物素标记的启动子片段的扩增 22 3.5.2 凝胶迁移实验（EMSA ） 22 3.6 鸭疫里氏杆菌Nlp/P60 基因缺失株的构建 25 3.6.1 引物设计 25 3.6.2 RA-YM Nlp/P60 基因左右臂的扩增 25 3.6.3 壮观霉素抗性基因（Spec ）的扩增 25 3.6.4 Overlap PCR 扩增连接 26 3.6.5 阳性克隆的鉴定 26 3.6.6 重组自杀性质粒pRE112-Nlp/P60-LSR 的构建 26 3.6.7 Nlp/P60 基因缺失株的构建 27 3.6.8 Nlp/P60 基因缺失株及其筛选鉴定 27 3.7 Nlp/P60 基因缺失株生物学特性的研究 27 3.7.1 Nlp/P60 基因缺失株遗传稳定性分析 27 3.7.2 Nlp/P60 基因缺失株生长曲线的测定 28 II 鸭疫里氏杆菌PhoP/PhoR 双组份系统对基因表达的调控及基因岛整合酶功能研究 3.8 Nlp/P60 基因缺失株对雏鸭LD50 的测定28 4 结果与分析28 4.1 差异表达基因的功能及GO 富集分析28 4.2 多种细菌PhoP/PhoR 双组份系统进化分析 31 4.3 PhoP 蛋白的表达与纯化 31