【国自然】导多能干细胞（iPS）的重编程机制.docxVIP

项目名称： 诱导多能干细胞（iPS）的重编程机制 首席科学家： 王纲 中国科学院上海生命科学研讨院 起止年限： 2009.1至2013.8 依托部分： 中国科学院 一、研讨内容 依据以上的立项依据，本项意图首要研讨内容将会集在以下几个方面： iPS细胞被重编程的分子机制 从核移植（克隆动物的根底）咱们得知，细胞核能够被胞质重编程。iPS的呈现说明四个因子（或其他几个因子）能够重编程体细胞。现在咱们不知道使重编程产生的要害分子事情是什么。咱们将从表观遗传润饰的改动、microRNA的改动和基因表达谱的改动几个方面来研讨iPS中重编程的分子机理。 1.1 表观遗传改动 基因表达活性调控的机制首要是经过染色质水平的化学润饰（包含组蛋白上的润饰），构成有转录活性的常染色质和无转录活性的异染色质区域。染色质组分（组蛋白与DNA）的各种润饰在细胞内由不同的酶类催化完结。胚胎干细胞、成体细胞或已分解细胞具有各不相同的特异性的染色质润饰谱式。这些润饰谱式在体细胞去分解时产生失常（重编）。已有试验证明MEF细胞的Oct4和Nanog基因的发动子在iPS构成进程中产生去甲基化。由于DNA甲基化引起基因转录缄默沉静，因而去除全能性基因上的DNA甲基化是激活全能性基因的重要进程。也是iPS诱导进程中一系列分子事情中的一大限速进程。隔阂，由于在转录调控中，DNA甲基化和组蛋白的润饰归于一同发挥效果的共同体，因而，研讨DNA甲基化在iPS中的效果，必需求研讨该进程中组蛋白润饰的改动。咱们将在iPS诱导体系中，运用ChIP-on-chip芯片研讨剖析和发现组蛋白润饰的动态改动。在此根底上，经过有意图地改动DNA甲基化和组蛋白润饰的动态平衡，探究简化iPS诱导办法的或许战略，如不依靠反转录病毒导入外源转录因子等。说明体细胞重编程进程中各分子事情间的彼此联络,然后为iPS技能革新供给依据。 1.2 microRNA的改动 诱导已分解的体细胞成为多能性的干细胞(iPS)是一个杂乱的进程。最近的研讨发现microRNAs在坚持干细胞的多能性发挥了重要的效果, 损坏microRNA会导致胚胎干细胞分解反常以及精原干细胞在体内的缺失。研讨发现，小鼠和人的胚胎干细胞具有一套特异的microRNAs，它们定位在染色体上成一簇，并与Oct4,Sox2和Nanog有彼此效果，提示这些microRNAs参加坚持胚胎干细胞的多能性。因而咱们估测microRNAs在iPS的诱导和坚持中也有重要效果，是全面解析iPS诱导分子机制不行短少的一部分. 咱们将进行以下的研讨：1，用Lentiviral病毒载体来诱导表达Oct4，Sox2，Nanog，Lin-28，树立可重复的iPS诱导体系,剖析和发现general microRNAs和胚胎干细胞特异的microRNAs被激活的时刻图谱；2，然后挑选在不隔阂间激活的胚胎干细胞特异的microRNAs与Oct4，Sox2，Nanog共转染分解细胞,剖析相应的microRNA是否对iPS的诱导有促进效果；3，在前述根底上，挑选有显着促iPS诱导效果的microRNA，以此为探针，寻觅其在调控多能性干细胞的信号传导和体现润饰的靶点以及调控机制。 1.3 iPS中的信号通路 iPS细胞是经过在成体细胞中转入四个因子（即转录因子）完结的。除了表观遗传学润饰改动以外，转入的转录因子必定引起相应的基因转录激活等一系列事情。因而咱们将对iPS细胞在基因表达水平上进行广谱性的研讨，了解体细胞重编程进程中有哪些基因表达产生显着改动；这些显着改动的基因具有怎样的时序表达规则；这些显着改动的基因之间或许构成哪些要害的调控网络，它们决议侧重编程的全进程以及细胞的命运。咱们将1. 剖析体细胞、iPS以及胚胎干细胞（ESC）的基因表达差异，承认显着性上调的和下调的基因；2. 剖析体细胞在重编程进程中不隔阂间的基因表达改动，承认每一天显着性上谐和下调的基因，然后清晰基因表达在全体水平上的时序性；3. 依据以上效果剖析承认的基因，别离按重编程进程中细胞改动最显着的5个方面，即细胞周期，能量代谢，染色质DNA甲基化，组蛋白润饰以及细胞黏附分子，进行聚类，取得在以上5个方面基因表达改动最为显着的亚群，依据文献中的已知基因功用信息，开始承认或许的基因表达调控网络；4. 运用定量PCR结合过表达或shRNA下调意图基因表达，验证以上剖析效果中的基因表达改动和调控网络模型。此外，咱们将重视人类iPS细胞构成进程中，坚持hESCs全能性及自更新至关重要的Activin，FGF信号通路的表达改动状况：其表达改动是否被Oct4，Nanog，Sox2和Lin28等外源基因调控；其表达改动是否对iPS细胞的构成所必需。在人类iPS细胞系构成之后，Activin，FGF信号对其正常坚持及扩增是