9.1总论第II部-遗传变异的创造-第九章-细胞融合1-原生质体的分离.pdf

111 第九章 植物原生质体培养和细胞融合 植物原生质体是一个没有壁的细胞，由于没有壁及质膜暴 露在外界环境下，使原生质体的结构变得很脆弱，在没有 一定的渗透剂和稳定剂的情况下，很快会破裂。 由于上述 特点，使得原生质体的操作难度较大，可一旦再生了壁就 恢复了细胞的全能性，具有了同正常细胞一样的特性。 2 9-1 原生质体的分离 原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及 不损害它的再生能力，其先决条件是要有一个合适的渗 透压。 3 （一）分离方法 分离原生质体的方法一般有两种：机械法分离和酶法分离。 机械法分离是早期采用的分离方法，先对材料进行质壁分离处理， 然后切割，这一过程中会释放出少量的不受损伤的原生质体。用 这一方法仅能从液泡很大的材料获得原生质体，而不能应用于分 生细胞。 4 酶法分离原生质体是目前常用的方法，可分为一步法和二步 法。一步法是将果胶酶和纤维素酶等混合处理材料，直接 分离获得原生质体。 二步法是先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离， 再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。目前多用一步法。 5 （二）影响原生质体分离的因素（6个因素） 1.材料来源 叶肉细胞是常用的材料，因为叶片很易获得而且能充分供应；其 次为愈伤细胞或细胞悬浮培养物。 6 从叶片来源的原生质体在遗传上较一致，而培养细胞来源的 原生质体则不然，因为培养细胞在培养过程中易产生变异。但 由愈伤或悬浮系来源的原生质体，可以避免植株生长环境的不 良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操 作简便，无需消毒。 7 此外，从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体 等均能分离原生质体。 8 2.渗透压 原生质体分离之前必须确定一个适合的渗透压。在这种渗透压下， 原生质体的分离、纯化过程中都不致使原生质体受损伤。 9 分离原生质体常用的配制酶液及洗涤原生质体的溶液为 CPW溶液，CPW盐的成分为：KH PO 27.2mg/L, KNO 2 4 3 101.0mg/L, CaCl .2H O 1480.0mg/L, MgSO .7H O 246.0mg/L, 2 2 4 2 KI 0.16mg/L, CuSO .5H O 0.025mg/L, pH 5.8 。 4 2