9.总论第II部-遗传变异的创造-第九章-细胞融合3-细胞融合.pdf

111 （续 第九章 植物原生质体培养和细胞融合 2 ） 2 9-3 细胞融合（体细胞杂交） 物种间生殖隔离阻碍了物种间的基因交流，从而给作物育种 带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一 条途径，目前利用细胞融合已从很多作物种、属间，甚至科 间获得体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型， 有效地拓宽了植物育种的资源。 3 （一）融合方法 （4种） 分离的原生质体不带电荷，它们相互排斥，所以一般要在 诱发条件下才能发生融合。异种原生质体首先发生膜接触， 然后两个原生质体形成细胞质桥，最后两种细胞质将两个 核包围起来而完成融合。常用的融合方法简单介绍如下： 4 1. NaNO3处理诱发融合 由NaNO3诱导的可重复、控制的离体原 生质体融合是由Power等（1970）报道的。利用这一融合剂， Carlson等（1972）虽然在植物中获得了第一个体细胞杂种，但 这种方法存在的严重缺陷就是融合频率低，而且对于来源于叶 肉的高度液胞化的原生质体有害。这种融合的机制一般认为是 Na+造成了膜电位的改变。 5 2.高pH—高浓度钙离子处理 烟草叶肉原生质体在高Ca+ （0.05M 0 CaCl ）和高pH （10.5）条件下能很快诱发融合（37 C ），但融 2 合频率不很高，高pH也影响原生质体的存活率，且易诱发多个 原生质体融合。高Ca++高pH诱发融合的机制尚不很清楚，一般 认为是改变了膜电位及膜的物理结构。 6 3. PEG （聚乙二醇）处理 PEG诱导不仅融合率高，而且使 二核融合体频率增加且无特异性。PEG是一个高分子量的 多聚体（1500—6000），25%～50%PEG可立刻刺激原生 质体引起收缩，随后发生聚集。 7 PEG诱发融合后应逐步去除。影响原生质体聚集及随后的 融合的因子很多，如PEG的分子量及浓度、原生质体的材料 来源、分离原生质体时使用的酶制剂、离子的种类和浓度、 融合温度等。 8 4.电融合 当两个原生质体处于接触状态时，给一个5~12µA 的电流持续1~5秒钟，原生质体首先受刺激，然后马上融合。 应用电融合时，原生质体轻微收缩，表明其膜状态有一个 短暂的变化。 9 电融合包括两个步骤：①电泳：在电极的作用下，原生质 体泳到一