持续高血压状态自发性高血压大鼠血清代谢组学研究.docxVIP

持续高血压状态自发性高血压大鼠血清代谢组学研究 高血压病是多基因与多因素共同作用、影响机体正常代谢的异质性疾病。据预计，到2025年，全球高血压患者人数将增至15.6亿然而，目前以SHR为对象的代谢组学研究观察时间大多为4周左右且多以比较药物干预效果的研究为主1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物随机获取SPF级8周龄雄性SHR和同周龄雄性WKY大鼠各6只，SHR体重约180 ~ 200 g，设为模型组，WKY大鼠体重约185 ~ 205 g，设为对照组。所有大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证号【SCXK（京）2016-0006】。以标准饲料将所全部大鼠分笼饲养于中日友好医院临研所动物实验中心SPF级实验室【SYXK（京）2016-0043】，每笼3只，环境适宜，温度在（25 ± 3）℃左右，湿度波动于45% ~ 55%之间，通风良好，光照时间12 h按时交替，无异常噪音刺激，可自由获取水和食物。动物饲养全程均严格按照中日友好医院伦理委员会要求（审批号：No.180209）。1.1.2 主要试剂与仪器冷冻生理盐水（0.9% NaCl）；4%甲醛溶液；伊红-苏木素（hematoxylin-eosin，HE）染料；Masson三色染色液；标准品（色谱纯，昆明BioBioPha公司/德国Sigma-Aldrich公司）；甲醇（色谱纯，美国Merck公司，货号I1014107923）；乙腈（色谱纯，美国Merck公司，货号JB0886630）。BP 2000小动物无创血压分析系统（美国Visitech Systems公司）；石蜡切片机（日本SAKURA公司）；台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；正置光学显微镜（日本Olympus公司）；QTRAP 6500+三重四级杆质谱（美国SCIEX公司）；超高效液相色谱（日本SHIMADZU公司）；色谱柱（美国Waters公司）。1.2 方法1.2.1一般特征各组大鼠毛发颜色、营养和精神状态、体重、进食饮水、打斗以及大便情况。1.2.2 血压在大鼠清醒、环境安静的前提下，每周于同一时间、同一通道将其置于39鼠BP2000平台固定器中，放置约10 min（使大鼠适应、尾动脉充分扩张），再测量其尾动脉SBP。取第0、30、60、90、120天的血压结果用于分析，其中每个时间点每组大鼠连续检测20组收缩压（systolic blood pressure，SBP）值，最终选取波形更理想的6组数据的均值作为计算值。1.2.3 HE染色和Masson染色3%戊巴比妥（1 mL/kg）腹腔注射使大鼠麻醉，腹主动脉采血后用10 mL注射器抽取冷冻生理盐水于左心房注入，灌注至主动脉管腔接近呈于蛋白透明，迅速解离心脏，用冰盐水再次清洗，其后垂直于心脏左室中轴约上中1/3处切取横断组织约1 cm，放入4%甲醛溶液中，固定24 ~ 72 h后进行脱水、石蜡包埋、切片（3 mm），完成HE染色和Masson染色，封片后镜下观察。1.2.4 血清采集及代谢组学检测 禁食24 h，3%戊巴比妥（1 mL/kg）腹腔注射麻醉后经腹主动脉采血，室温静置2 h，3000 r/min离心10 min后取上清液，分装后冻于-80℃。取出时先置于冰上解冻并混匀。取50 μL样本并按1:3比例加入预冷的冰甲醇（含内标）。涡旋3 min，12 000 r/min、4℃离心10 min后取上清液，同样条件再离心5 min，得到上清液用于分析。液相条件：HSS T3 C18 1.8 μm（2.1 mm × 100 mm）色谱柱；柱温40℃；流速0.4 mL/min；进样量2 μL样。流动相A为水（0.04% 乙酸）：B为乙腈（0.04% 乙酸）；洗脱顺序为0 min，95：5 V/V；11 min，5：95 V/V；12 min，5：95 V/V；12.1 min，95：5 V/V和14 min，95：5 V/V。同时为保证检测的稳定性和可重复性，每10个检测分析样本中插入1个由所有样本提取液混合而成的质控样本。质谱条件：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）温度为500℃，离子源检测分为正负离子模式，离子喷雾电压分别为 + 5.5 kV和 - 4.5 kV，离子源气体I设为55 psi，气体II为60 psi，气帘气为25.0 psi。另，设置碰撞诱导电离参数为高。1.3 统计学分析数据经预处理后使用R包（）完成主成分分析（principle component analysis，PCA）、聚类热图、Pearson相关性热图等，并利用MetaboAnalyst R完成正交偏最小二乘判别