MidkinemRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其意义临床医学.docVIP

MidkinemRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其意义临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：MidkinemRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其意义临床医学 1 1 材料与方法 2 2 结果 4 1）P 5 3 讨论 5 文2：肾癌患者外周血中survivinmRNA的表达临床医学 7 1 资料与方法 7 2 结 果 8 1、2、4、5为阴性，第3泳道清晰显示28S、18S两条带 9 3 讨 论 9 参考文摘引言： 12 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 14 正文 MidkinemRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其意义临床医学 文1：MidkinemRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其意义临床医学 研究表明，恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就有癌细胞入血，即微转移（micrometastasis），它是肿瘤的恶性标志和主要特征之一，也是导致 治疗 失败和患者死亡的主要原因之一。因此，早期诊断肿瘤微转移是提高恶性肿瘤治疗效果、改善患者预后的有效途径之一[12]。而巢式RTPCR可在1×107个单个核细胞中检出1～10个肿瘤细胞，其敏感性、特异性远高于其他方法[3]。迄今为止，国内外尚未见食管鳞癌患者外周血中期因子(midkine，MK)mRNA表达情况的研究报道。本研究拟用巢式RTPCR方法检测食管鳞癌患者外周血的MK mRNA表达，并探讨其与食管鳞癌生物学行为的关系。 1 材料与方法 材料 样本 54例食管鳞癌患者均为东南大学附属中大 医院 胸外科2004~2006年的住院患者，所有病例均经病理确诊；男40例，女14例；年龄46～83岁，平均岁。取术前患者外周血3ml。以11例食管鳞癌肿瘤组织标本为阳性对照，10例健康志愿者外周血为阴性对照。 试剂 淋巴细胞分离液和DEPC为南京生兴生物技术有限公司产品，Trizol试剂、RTPCR试剂盒及Taq酶等为日本TaKaRa公司产品。 引物 参照有关 文献 ，采用Primer5引物设计软件自行设计，所有引物均由江苏百龙基因有限公司合成。引物序列见表1。 表1 βactin和MK基因的引物序列（略） Tab1 Primer sequences of βactin and MK 方法 样本处理及总RNA提取 抽取术前患者外周静脉血3ml，以枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法常规分离单个核细胞。肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。Trizol一步法分别提取总RNA20μl，将提取的RNA于紫外分光光度计上定量，并行10%琼脂糖凝胶电泳，以明确RNA未降解。 逆转录合成cDNA和PCR扩增 所有标本各取5μl RNA，70℃6min变性，根据TaKaRaRNA试剂盒进行cDNA第1链合成，行MK巢式PCR。第1轮PCR：取μl，10×μl，25mmol·L－μl，10mmol·L－μl，10pmol·L－1第1轮PCR上、下游引物各μl，TaqDNA聚合酶，加灭菌水至25μl。反应条件：94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃60s，30个循环；72℃5min延伸。第2轮PCR：取第1轮PCR产物μl作模板，加10pmol·L－1第2轮PCR上、下游引物各μl，除退火温度改为53℃外，余反应体系及反应条件同前。选择βactin基因作为内参照质控指标。PCR反应中加入其上、下游引物各μl，扩增条件除退火温度改为56℃外，余反应体系及反应条件同前，但只进行1轮扩增。 RTPCR产物鉴定 将第1轮PCR产物双向测序，并取第2轮MK PCR产物及βactinPCR产物各5μl加样于%琼脂糖凝胶进行电泳，电压80V，电泳约25min，然后用紫外光凝胶成像系统扫描并拍照。在相应位置(531、272bp)出现肉眼可见条带判为阳性(图1)。MK产物带272 bp，βactin产物带531bp ；1.肿瘤组织阳性对照；2.健康捐献者外周血阴性对照；3～7.患者外周血 图1 3种标本PCR产物琼脂糖凝胶电泳示例（略） Fig 1 Example of three kines of PCR products separated by gel electrophoresis 统计学处理用SPSS软件分析各组数据，P为差异有统计学意义。 2 结果 MK mRNA测序结果PCR产物采用上、下游引物进行双向测序，结果如下：5′ATGCAGCACCGAGGCTTCCTCCTCCTCACCCTC CTCGCCCTGCTGGCGCTCACCTCCGCGGTCGCCAAAAA　GAAAGATAAGGTGAAGAAGGGCGGCCC