P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究临床医学.docVIP

P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究临床医学 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究临床医学 1 1 材料和方法 2 2 结果 3 3 讨论 5 文2：大鼠急性坏死性胰腺炎时P物质在肠壁上的表达及其与肠黏膜通透性 6 1 材料和方法 7 参考文摘引言： 9 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究临床医学 文1：P物质受体拮抗剂对急性坏死性胰腺炎时肺损伤保护作用的实验研究临床医学 急性坏死性胰腺炎（ANP）是外科重危急症之一，病理演变迅速，病情险恶。ANP时最易受损的靶器官是肺，50%~70%的急性胰腺炎病人肺功能受损，部分 发展 为急性呼吸窘迫综合征(ARDS) [1]。因此，防治肺损伤对提高ANP疗效有着重要的意义。ANP并发肺损伤的发病机制尚未完全清楚。近来的研究表明，P物质在炎性疾病中起到重要的作用[23]。 P物质与3种G蛋白偶联的神经激肽受体结合，分别为神经激肽1受体(NK1R)、神经激肽2受体(NK2R)和神经激肽3受体(NK3R)。我们以往的研究表明，ANP时肺组织中NK1R的表达水平明显上调，扰乱了神经激肽的作用环节，加剧了ANP 时的肺损害[4]。本研究通过制作ANP模型，予NK1R拮抗剂干预，探讨NK1R拮抗剂在ANP肺损伤发病机制中的作用，为ANP肺损伤的防治提供一条可能的途径。 1 材料和方法 ANP模型制作健康成年SD大鼠90只，体重250～280 g。实验前大鼠禁食12～16h，不禁水。2%戊巴比妥钠 ml·kg－１腹腔注射麻醉。60只大鼠采用胆胰管内逆行注射5%牛磺胆酸钠( ml·kg－１)建立ANP模型。正常对照组（30只）仅将十二指肠提出切口，轻轻翻动胰腺3次，不注射牛磺胆酸钠，余操作步骤与下述ANP组相同。将已成功制备的ANP模型大鼠随机分为以下两组：（1）ANP组(30只)，制模成功后经尾静脉注射09%生理盐水 ml；（2）拮抗剂组(30只)，制模成功后经尾静脉注射NK1R拮抗剂 25% spantide (Sigma 公司) ml。分别于6、12和24h处死大鼠(各10只)，留取部分肺脏、胰腺和门静脉血标本，立即切成块状并投入液氮，保存于－80℃超低温冰箱中，或经福尔马林固定后脱水包埋、常规切片。 淀粉酶和肺髓过氧化物酶(MPO)活性的测定血液分离血浆后进行淀粉酶检查(碘淀粉比色法)。肺组织匀浆后超声粉碎成亚细胞成分，肺组织MPO活性测定按照MPO检测试剂盒(Sigma公司)进行。 肺毛细血管通透性(LCP)的测定采用伊文思蓝浸入法测定各组大鼠的LCP。经尾静脉穿刺注入2%伊文思蓝（1 ml·kg－１），15 min后处死动物，剖胸后由右心室匀速注入10 ml生理盐水冲洗血管内染料，取出肺脏，将肺表面水分吸尽后，于 电子 天平上称取湿重，放入4 ml甲酰胺中，于37℃温箱放置24h，提取组织中染料。过滤后染液用分光光度计于620 nm处读取OD值，通过标准曲线 计算 提取出的染料量，以单位组织中染料提取量反映LCP。伊文思蓝标准曲线的建立方法：分别取%伊文思蓝标准品0、5、15、20、30、40μl，加入4 ml甲酰胺中，620 nm比色，将数据进行回归分析，得到回归方程：OD=，r=。 免疫组织化学检测分析石蜡切片经过脱蜡至水后，浸泡在TBS缓冲液（10 mmol·L－1 TrisHCl,% NaCl，% TritonX100，pH ）中15 min，用稀释度1∶200的羊抗大鼠NK1R多克隆抗体（Santa Cruz公司）于4℃湿盒内孵育过夜，二抗为兔抗羊IgG（美国Kirdegarrd Perry Laboratories 公司），室温下孵育30 min，TBS振洗3遍后加链霉亲合素过氧化物酶复合物，室温下孵育30 min，滴入新鲜配制的显色溶液（美国Kirdegarrd Perry Laboratories 公司），然后苏木精衬染细胞核，逐步脱水，二甲苯透明，最后用中性树脂封片。 统计学处理实验结果以x-±s表示，用Prism软件包（美国圣地亚哥GraphPad软件公司）进行统计学分析。组间差异用MannWhitney U检验或精确卡方检验，P为差异有显著意义。 2 结果 淀粉酶检查和胰腺病 理学 检查与正常对照组相比，ANP组血淀粉酶显著升高。开腹证实腹腔内有血性腹水，可见胰腺出血斑和坏死灶。镜下病理检查也证实ANP的发生，还可见肺泡壁塌陷，间质毛细血管扩张、充血，肺泡隔中性粒细胞浸