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抑胶素对大鼠脑胶质瘤增殖细胞核抗原表达的影响 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：抑胶素对大鼠脑胶质瘤增殖细胞核抗原表达的影响 1 1 材料与方法 2 2 结 果 4 3 讨 论 4 文2：放射治疗对人宫颈癌组织的增殖细胞核抗原表达的影响 6 0 引言 7 1 材料和方法 7 2 结果 8 3 讨论 9 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 12 文章致谢（模板） 12 正文 抑胶素对大鼠脑胶质瘤增殖细胞核抗原表达的影响 文1：抑胶素对大鼠脑胶质瘤增殖细胞核抗原表达的影响 神经胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，是颅内肿瘤中最常见的一种，因其侵袭性生长的特性，手术难以完全切除，复发率极高，因此，寻求一种高效低毒、特异性高、不易发生耐药的抗胶质瘤药有重要意义。抑胶素(antigliomatin)作为一种特异性氯离子通道阻滞剂，是一种蝎毒素多肽。为观察其抑瘤效应及探讨其抗肿瘤的作用机制〔1〕，本研究观察了其对大鼠脑胶质瘤形态学的影响及对脑胶质瘤细胞增殖细胞核抗原的作用。 1 材料与方法 细胞株和实验动物 大鼠C6脑胶质瘤细胞株是由雄性大鼠静脉注射硝甲基脲而诱发产生的恶性胶质瘤细胞株。本实验所用的瘤株由吉林大学病理毒 理学 教研室提供。抑胶素由吉林大学基础医学院生理教研室提供。动物选用雄性、健康Wistar大鼠50只，鼠龄6～8 w，体重200～250 g，由高新技术开发区动物中心提供。 细胞培养〔2〕 将C6大鼠脑胶质瘤细胞株复苏成功后，接种于25 cm2培养瓶中，采用单层贴壁培养法。将复苏后的C6胶质瘤细胞加入含10%灭活小牛血清的IMDM培养液中,置于含5%CO2、37℃恒温密闭式孵箱中培养，每周传代2次。当细胞增殖进入对数阶段，培养瓶细胞长满时，先倒去培养液，用%胰酶溶于不含Ca2+、Mg2+的磷酸盐缓冲液中消化细胞，在显微镜下观察到细胞开始皱缩时加入营养液中和，反复吹打，使之脱壁，1 000 min离心5 min，弃上清，制成细胞悬液。体外培养的C6胶质瘤细胞爬片常规应用免疫组化(SABC法)检测GFAP蛋白的表达，阳性细胞胞浆呈现棕黄色着染。 接种方法 收集对数生长期生长状态良好的C6细胞，细胞浓度为×106/10 μl，经MTT法检测细胞存活率达90%以上。以×106个细胞/只鼠的量接种，所有的大鼠均采用立体定向方法进行接种。根据Barker法确定切口和钻孔位置，在大鼠脑立体定位仪上选取大鼠脑右侧尾状核区为靶点，从头部正中矢状面交点向后纵向切开皮肤，暴露颅骨标志，按前述坐标点定位，用牙科钻在颅骨上钻孔，孔径 mm，用10 μl的微量注射器针头锐性刺破硬膜在立体定向引导下接种针垂直缓慢延伸至硬膜下 mm，再后延 mm于硬膜下 mm靶点处，将10 μl细胞悬液以1 μl/min缓慢注入靶区，留针5 min，使细胞充分沉积，缝合头皮。每只大白鼠每天给予青霉素10万U腹腔注射共5 d以预防感染。 动物分组 荷瘤7 d后将全部Wistar大鼠随机分为5组，每组10只。以不同浓度抑胶素灌胃治疗14 d，具体如下：(1) 空白对照组：用生理盐水对照;(2)实验组：抑胶素不同浓度组(Ⅰ：8 μg/kg;Ⅱ：16 μg/kg;Ⅲ：32 μg/kg;Ⅳ：64 μg/kg) 观察用药前后肿瘤体积变化、计算抑瘤率 用药后活体灌注4%多聚甲醛固定肿瘤标本，沿脑表接种穿刺点做冠状切口，测量肿瘤大小，肿瘤体积=a2×b×π/6(a为肿瘤的短径，b为肿瘤的长径)。抑瘤率=(对照组肿瘤的平均体积-实验组肿瘤的平均体积)/对照组肿瘤的平均体积×100%，抑制率≥30%为肿瘤对药物敏感。 免疫组化染色检测增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白 采用SABC法，石蜡切片脱蜡至水，3%双氧水阻断10 min,微波修复抗原10 min。10%正常山羊血清封闭非特异性抗原室温下60 min。倾去血清，加1∶100稀释的PCNA，置湿盒内4℃过夜。PBS冲洗5 min×3次，滴加生物素化二抗工作液，加盖湿盒内室温下60 min。PBS振洗5 min×3次。加入SABC复合物，室温下60 min，PBS振洗5 min×4次。DAB显色液显色。苏木素衬染3 min。自来水冲洗，酒精水化，二甲苯透明，中性树胶封片。正常脑组织为正常对照，结果以胞核或(和)胞质中出现棕黄色颗粒为阳性，高倍视野下(400倍)阳性细胞数所占总肿瘤细胞的百分率即为PCNA标记指数(LI) 统计学分析 采用SPSS统计分析软件，计量资料采用x±s表示，并计算抑瘤率，然后进行t检验。 2 结 果 实验大鼠的肿瘤体积和抑瘤率的变化 活体灌注4%多聚甲醛固定肿瘤标本，沿脑表接种穿刺点做冠状切口，测